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.2018年12月28日；16（12）：e2005907。
doi:10.1371/journal.pbio.2005907。 eCollection 2018年12月。

足蛋白+肿瘤淋巴管是乳腺癌转移的限速因素

杨晨 1, 多鲁克·凯斯金 1 2, 杉本海卡鲁 1 2, 金崎敬三 2, 帕特里夏·E·菲利普斯 1, 劳伦·比萨罗 1, 阿琳·夏普 三, 瓦莱丽·S·勒布鲁 1 2, 拉胡·卡卢里 1 2
附属公司

足蛋白+肿瘤淋巴管是乳腺癌转移的限速因素

杨晨等。 公共科学图书馆生物. .

摘要

转移性传播利用血液和淋巴血管系统。实体肿瘤在肿瘤进展过程中动态重塑并生成两种血管类型。淋巴管浸润和肿瘤引流淋巴结中的癌细胞是乳腺癌转移和患者预后的预后标志，肿瘤诱导的淋巴管生成可能影响转移。与肿瘤淋巴管生成相关的肿瘤组织液稳态和免疫运输失控可能有助于转移扩散；然而，肿瘤中淋巴管内皮细胞（LECs）的精确功能特征受到了挑战，因为缺乏特异性试剂来解释其在转移中的速率限制作用。因此，我们产生了新的转基因小鼠（PDPN启动子驱动的Cre重组酶转基因[PDPN-Cre]和PDPN发起子驱动的胸苷激酶转基因[PDPN-tk]），用于鉴定和基因控制表达增殖足蛋白（PDPN）的LEC。我们证明，在PDPN-tk小鼠中诱导的淋巴管瘤病变中成功地实现了对淋巴管生成的抑制。在多转移性乳腺癌小鼠模型中，我们确定了LECs在原发性和转移性肿瘤中的不同作用。我们的发现支持原发性肿瘤淋巴管生成在控制腋窝淋巴结和肺实质转移中的功能性作用。淋巴管密度降低会增加原发性肿瘤淋巴水肿，增加瘤内巨噬细胞的频率，但尽管转移扩散显著减少，但对原发性癌生长没有显著影响。我们的研究结果确定了乳腺癌淋巴管对肺转移的速率限制作用。

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数字

图1
图1。PDPN-tk和PDPN-Cre转基因小鼠的特性。
（A） 演示产生PDPN-tk小鼠株或具有4-kb的PDPN-Cre小鼠株的示意图PDPN（PDPN）使用pCR2.1-TOPO载体分别连接到HSV病毒tk序列或Cre重组酶序列的启动子序列。（B） PDPN-Cre眼睛的YFP可视化；LSL-YFP和对照小鼠。从IFA诱导的良性淋巴管内皮瘤（淋巴管瘤）中分离出的原发性LECs，检测PDPN-Cre中YFP和PDPN的表达；LSL-YFP小鼠。比例尺，20μm。（C） 在PDPN-tk或WT对照小鼠中，对从IFA诱导的淋巴管瘤中分离出的GCV处理的原发性LEC进行细胞活性测定。（D） 与未经GCV治疗的WT小鼠或PDPN-tk小鼠相比，GCV治疗PDPN-tk小鼠IFA诱导的淋巴管瘤形成(n个=每组6只小鼠）。GCV治疗为每天腹腔注射50 mg/kg体重的GCV。（E） 来自PDPN-tk和WT小鼠的淋巴管瘤组织样本的组织学。（F） PDPN-tk和WT小鼠淋巴管瘤组织样本的Ki67染色。（G） PDPN-tk和WT小鼠淋巴管瘤组织上PDPN（红色）和Ki67（绿色）的免疫荧光染色。白色箭头表示PDPN和Ki67双阳性细胞的细胞核。比例尺（E–G），100μm。数据表示为平均值±SEM。显著性由未配对的双尾学生确定t吨测试(*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001). 基本数据可以在S1数据中找到。Cre、Cre重组酶转基因；GCV，更昔洛韦；H&E、苏木精和伊红；单纯疱疹病毒；IFA，不完全弗氏佐剂；Ki67，细胞增殖抗原Ki-67；淋巴管内皮细胞；LSL、LoxP-Stop-LoxP；NS，不显著；pCR2.1-TOPO，拓扑异构酶I激活的pCR2.1-TOPO载体；PDPN，足蛋白；tk，胸苷激酶；野生型野生型；YFP，黄色荧光蛋白。
图2
图2。增生性LEC的耗竭抑制淋巴管生成。
（A和B）PDPN-tk或WT小鼠皮下植入基质凝胶塞（生长因子减少，提供VEGF-C或PBS）中的淋巴血管生成和/或血管生成(n个=每组5只小鼠）。采用PDPN和CD31免疫荧光染色（A）检测淋巴管密度和血管密度。通过PDPN（B）的IHC染色评估总淋巴管密度。比例尺（A-B），100μm。（C） PDPN-tk或WT小鼠中的原位4T1乳腺肿瘤(n个=每组5只雌性小鼠）检查肿瘤边缘和瘤内区域的淋巴管密度（PDPN染色）和血管密度（CD31染色）。比例尺，200μm。GCV治疗为每天腹腔注射50 mg/kg体重的GCV。白色箭头指向表达PDPN的淋巴管。S6B图中也描述了这些数据。数据表示为平均值±SEM。显著性由未配对的双尾学生确定t吨测试(*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001). 基本数据可以在S1数据中找到。CD，分化簇；GCV，更昔洛韦；IHC、免疫组织化学；淋巴管内皮细胞；NS，不显著；PDPN，足蛋白；tk，胸苷激酶；血管内皮生长因子C；WT，野生型
图3
图3。4T1乳腺肿瘤的肺转移通过抑制淋巴管生成而受到抑制。
（A） GCV治疗的PDPN-tk中原位4T1乳腺肿瘤的生长(n个=13）或重量(n个=14）雌性小鼠。GCV标签表示GCV治疗的开始日期。GCV治疗为每天腹腔注射50 mg/kg GCV。4T1肿瘤侵犯腋窝和/或腹股沟淋巴结的组织学鉴定；重量(n个=8）小鼠或4T1；PDPN-tk公司(n个=9）小鼠。（B和C）评估PDPN-tk或WT雌性小鼠携带4T1的表面转移性肺结节（B，白色箭头）和组织学鉴定的肺转移（C，黑色箭头）。基本数据可以在S1数据中找到。GCV，更昔洛韦；淋巴结；PDPN，足蛋白；tk，胸苷激酶；WT，野生型
图4
图4。MMTV-PyMT乳腺肿瘤的肺和淋巴结转移受到淋巴管生成抑制。
（A） GCV治疗MMTV-PyMT对自发性乳腺肿瘤生长的影响；PDPN-tk小鼠(n个=9）或MMTV-PyMT；WT雌性小鼠(n个= 13). GCV标签表示GCV治疗的开始日期。在切除肿瘤的代表性图片中，用白色箭头表示囊性肿瘤。（B） MMTV-PyMT的H&E和IHC（白蛋白或PDPN）染色；PDPN-tk或MMTV-PyMT；WT肿瘤。MMTV-PyMT显示了每只小鼠的囊性肿瘤数量；PDPN-tk或MMTV-PyMT；WT组。从IHC染色图像定量两组的白蛋白积累。（C） MMTV-PyMT对肺表面转移结节和组织学确诊肺转移的评估；PDPN-tk小鼠或MMTV-PyMT；WT小鼠。（D） MMTV-PyMT中肿瘤侵袭腋窝淋巴结的数量和每只小鼠的肿瘤总数；PDPN-tk小鼠或MMTV-PyMT；WT小鼠。比例尺（C-G），100μm。数据表示为平均值±SEM。显著性由未配对的双尾学生确定t吨测试(*第页< 0.05, **第页< 0.01). 基本数据可以在S1数据中找到。GCV，更昔洛韦；H&E、苏木精和伊红；IHC、免疫组织化学；LN、淋巴结MMTV-PyMT、小鼠乳腺肿瘤病毒-多瘤中间肿瘤抗原；NS，不显著；PDPN，足蛋白；tk，胸苷激酶；WT，野生型
图5
图5。淋巴管生成受到抑制时的肿瘤免疫状况。
（A） 844例乳腺癌患者PDPN相关mRNA水平与淋巴结转移的相关性，这些患者的RNA Seq V2 RSEM和TCGA乳腺浸润癌数据集中检测的淋巴结转移计数（由H&E确定）都有可用数据。PDPN水平表示为相对mRNA表达标准化为Gapdh公司家政基因。表中还显示了总病例中淋巴结转移阳性病例数（χ2分析）。（B） CD45的百分比+，CD3+，CD4+和CD8+PDPN-tk或WT小鼠4T1原位乳腺肿瘤中的细胞(n个=每组9只小鼠）。（C） CD11b的百分比+，CD11b+第1组−（Ly6C−赖氨酸6G−)和CD11b+第1组+PDPN-tk或WT小鼠4T1原位乳腺肿瘤中的细胞(n个＝每组9只小鼠）。（D） CD11b的百分比+赖氨酸6G+，CD11b+赖氨酸6C+，CD11c+细胞和CD4比率+福克斯P3−Teffs到CD4+福克斯P3+PDPN-tk或WT小鼠4T1原位乳腺肿瘤中的（Treg）(n个=每组9只小鼠）。数据表示为平均值±SEM。显著性由未配对的双尾学生确定t吨测试(*第页< 0.05). 基本数据可以在S1数据中找到。CD，分化簇；GCV，更昔洛韦；H&E、苏木精和伊红；淋巴结；PDPN，足蛋白；RNA Seq V2，RNA测序第2版分析；RSEM，标准化基因表达与RSEM输出；TCGA，癌症基因组图谱；Teff，效应T细胞；tk，胸苷激酶；Treg，调节性T细胞；野生型野生型。
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