Inhibition of LRRK2 or Casein Kinase 1 Results in LRRK2 Protein Destabilization

doi:10.1007/s12035-018-1449-2

.2019年8月；56(8):5273-5286.

doi:10.1007/s12035-018-1449-2。 Epub 2018年12月27日。

抑制LRRK2或酪蛋白激酶1导致LRRK_2蛋白失稳

T De Wit公司¹, V贝克兰特², E洛贝塞尔³

附属公司

¹比利时鲁汶，赫雷斯特拉特49号，鲁汶大学神经科学系神经生物学和基因治疗实验室，邮编：1023，3000。
²比利时鲁汶，赫雷斯特拉特49号，鲁汶大学神经科学系神经生物学和基因治疗实验室，邮编：1023，3000。veerle.baekelandt@kuleuven.be。
³比利时鲁汶，赫雷斯特拉特49号，鲁汶大学神经科学系神经生物学和基因治疗实验室，邮编：1023，3000。evy.lobbestael@kuleuven.be。

PMID： 30592011
预防性维修识别码：项目经理C6657425
内政部： 2007年10月17日/12035-018-1449-2

抑制LRRK2或酪蛋白激酶1导致LRRK_2蛋白失稳

T De Wit公司等。摩尔神经生物醇. 2019年8月.

.2019年8月；56(8):5273-5286.

doi:10.1007/s12035-018-1449-2。 Epub 2018年12月27日。

作者

T De Wit公司¹, V贝克兰², E洛贝塞尔³

附属公司

¹比利时鲁汶，赫雷斯特拉特49号，鲁汶大学神经科学系神经生物学和基因治疗实验室，邮编：1023，3000。
²比利时鲁汶，赫雷斯特拉特49号，鲁汶大学神经科学系神经生物学和基因治疗实验室，邮编：1023，3000。veerle.baekelandt@kuleuven.be。
³比利时鲁汶，赫雷斯特拉特49号，鲁汶大学神经科学系神经生物学和基因治疗实验室，邮编：1023，3000。evy.lobbestael@kuleuven.be。

PMID： 30592011
预防性维修识别码：项目经理C6657425
内政部： 2007年10月17日/12035-018-1449-2

摘要

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）基因的突变和变异与帕金森病（PD）发病风险的增加密切相关。大多数致病性LRRK2突变显示激酶活性增加，这被认为是LRRK2-介导毒性的基础。因此，人们投入了大量精力开发高效和选择性的LRRK2激酶抑制剂。其中一些化合物已被证明在细胞和体内有益，甚至在LRRK2野生型背景下也是如此。因此，LRRK2激酶抑制作为帕金森病的治疗方法具有很大的前景，目前已在临床前和早期临床研究中进行了测试。安全问题之一是小鼠和非人类灵长类动物的肺部病理学发展，这很可能与LRRK2激酶抑制后LRRK_2蛋白水平显著降低有关。在本研究中，我们旨在更好地了解慢性LRRK2激酶抑制的分子后果，这可能是进一步发展基于LRRK1激酶抑制剂的PD治疗的关键。我们发现LRRK2蛋白水平在长期LRRK2-激酶抑制期间没有恢复，但在停用抑制剂后恢复。有趣的是，LRRK2激酶抑制剂诱导的失稳并非发生在所有致病性LRRK1变异体中，LRRG2的N末端部分似乎在这一过程中起着关键作用。此外，我们确定CK1是LRRK2的上游激酶，在细胞培养和体内是LRRK1蛋白稳定性的调节器。我们认为，药物性LRRK2激酶抑制触发级联反应，导致CK1介导的尚未识别的LRRK1磷酸化位点的磷酸化降低。这个过程涉及LRRK2的N末端，并最终导致LRRK1蛋白降解。

关键词：酪蛋白激酶1；LRRK2；LRRK2激酶抑制剂；帕金森病；磷酸化；蛋白质稳定性。

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数字

图1
长期LRRK2激酶抑制剂治疗可诱导LRRK_2蛋白和磷酸化水平的持续降低，去除抑制剂后可完全恢复。以CZC-25146（200 nM）、PF-06447475（150 nM）或二甲基亚砜（DMSO）作为对照，对过度表达3Flag-LRRK2 WT的SH-SY5Y细胞进行治疗。取细胞裂解物(一)在治疗的几周内的不同日子或(b条)去除LRRK2激酶抑制剂24小时或72小时后，使用FlagM2抗体进行免疫印迹分析，以检测LRRK1、抗LRRK2P-S935、抗LRK2P-S1292、抗α-微管蛋白或抗小病毒蛋白，以检查等负荷。显示了具有代表性的斑点。(一,**c（c）**)图显示了印迹的定量，其表示总LRRK2与管家蛋白的比率或S935处的磷酸化与总LRRK2信号的比率。误差条指示S.E.MN个 ≥ 3.使用(一)使用Bonferroni事后测试进行双向方差分析测试，或(**c（c）**)曼希特尼U型测试。三个星号表示第页 < 0.001，双星号表示第页 < 0.01

图2
LRRK2激酶抑制剂治疗后，截断型LRRK_2的蛋白质水平没有降低。我们产生了SH-SY5Y细胞，过度表达3Flag突变体LRRK2(一)：LRRK2^823-2527或PLRCKW、LRRK2^702-2527或APLRCKW。细胞系要么未经处理(b条)或以PF-06447475（150 nM）、MLi-2（10 nM）或DMSO作为对照，进行不同时间段的处理(**c（c）**). 使用FlagM2抗体对细胞裂解产物进行免疫印迹分析，以检测LRRK2、抗LRRK2P-S935、抗LRR K2P-S1292或抗长春花碱，以等量加载。显示了具有代表性的斑点。图表显示了代表总LRRK2与看家蛋白信号之比或S935处磷酸化与总LRRK1信号之比的印迹定量。误差条指示S.E.MN个 ≥ 3.使用双向方差分析（ANOVA）检验和Bonferroni后验，或使用带Bonferrroni校正的列统计进行统计显著性检验。三个星号表示第页 < 0.001，双星号表示第页 < 0.01

图3
LRRK2激酶抑制不会导致去磷酸化致病突变体的失稳。未对过度表达LRRK2 R1441C、R1441G、Y1699C或I2020T的SH-SY5Y细胞进行治疗(一)或以PF-06447475（150 nM）、MLi-2（10 nM）或DMSO作为对照，进行不同时间段的处理(**b–e类**). 使用FlagM2抗体对细胞裂解产物进行免疫印迹分析，以检测LRRK2、抗LRRK2P-S935或抗病毒素。显示了具有代表性的斑点。图表显示了代表总LRRK2与看家蛋白信号之比或S935处磷酸化与总LRRK1信号之比的印迹定量。误差条指示S.E.MN个 ≥ 3.使用双向方差分析（ANOVA）检验和Bonferroni后验，或使用带Bonferrroni校正的列统计进行统计显著性检验。三个星号表示第页 < 0.001

图4
LRRK2变异体在LRRK_2激酶抑制时不会失稳，但在CK1抑制时会失稳。SH-SY5Y细胞过度表达LRRK2(一)WT，致病性：(b条)r1441克(**c（c）**)Y1699C或(d日)I2020T，截断：(**e（电子）**)PLRCKW或(**（f）**)以MLi-2（10 nM）、IC261（300μM）或二甲基亚砜（DMSO）为对照，对APLRCKW进行6至8小时的处理。使用FlagM2抗体对细胞裂解产物进行免疫印迹分析，以检测LRRK2，使用抗LRRK2P-S935或使用抗病毒蛋白对细胞裂解物进行等负荷分析。显示了具有代表性的印迹。图表显示了代表总LRRK2与看家蛋白信号之比的印迹定量。误差条指示S.E.MN个 ≥ 3.使用带Bonferroni校正的列统计检验统计显著性。三个星号表示第页 < 0.001，双星号表示第页 < 0.01

图5
残基S908、S910、S935、S955、S973或S976处的去磷酸化对LRRK2激酶抑制剂诱导的失稳不是至关重要的。SH-SY5Y细胞过度表达LRRK2(一,**c（c）**)6xSA（S908A/S910A/S935A/S955A/S973A/S976A）或(b条,d日)治疗6xSE（S908E/S910E/S935E/S955E/S973E/S976E）(一,b条)以PF-06447475（150 nM）、MLi-2（10 nM）或DMSO作为对照，在不同的时间段内(**c（c）**,d日)以MLi-2（10 nM）、IC261（300μM）或DMSO为对照，在6至8小时之间。使用FlagM2抗体进行LRRK2检测或使用抗病毒素进行等负荷免疫印迹分析细胞裂解产物。显示了具有代表性的斑点。图表显示了代表总LRRK2与看家蛋白信号之比的印迹定量。误差条指示S.E.MN个 ≥ 3.使用双向方差分析（ANOVA）检验和Bonferroni后验，或使用带Bonferrroni校正的列统计进行统计显著性检验。三个星号表示第页 < 0.001，星号表示第页 < 0.05

图6
CK1抑制诱导的LRRK2蛋白失稳也在体内发生。将LRRK2激酶抑制剂MLi-2（10 mg/kg）、CK1抑制剂PF-670462（50 mg/kg）或二甲基亚砜（DMSO）作为阴性对照，对C57Bl/6J小鼠进行四次腹腔注射，持续30小时。大脑(一)，肺(b条)、和肾脏(**c（c）**)在最后一次注射后2 h取出提取物，并使用MJFF-2抗LRRK2抗体、抗LRRK1 P-S935或抗α-微管蛋白或抗小黄芩素进行免疫印迹分析，以进行等量加载。显示了具有代表性的斑点。图表显示了代表总LRRK2信号与看家蛋白信号之比或S935处磷酸化与总LRRK1信号之比的印迹定量。误差条表示S.E.MN个 ≥ 3.使用带Bonferroni校正的列统计检验统计显著性。三个星号表示第页 < 0.001，双星号表示第页 < 0.01，星号表示第页 < 0.05

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