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.2019年1月8日；8（1）：e011211。
doi:10.1161/JAHA.118.011211。

血管平滑肌细胞核苷结合寡聚结构域样受体蛋白3缺乏预防慢性肾脏病动静脉瘘失败

丁香超 1, 陈九龄 1, 吴创彦 1 2, 王国华 1, 程舟 1, 陈珊珊 三 4, 王珂（Ke Wang） 5, 张安贞（Anchen Zhang） 6, Ping Ye公司 6, 吴杰 1, 陈珊珊 1, 张浩（Hao Zhang） 1, 徐开英 2, 王思华（Sihua Wang） 2, 夏家红 1
附属公司

血管平滑肌细胞核苷结合寡聚结构域样受体蛋白3缺乏预防慢性肾脏病动静脉瘘失败

丁香超等。 J Am心脏协会. .

摘要

背景动静脉瘘（AVF）是慢性肾脏病患者首选的血液透析途径。慢性肾脏疾病可增加新生内膜的形成，这通过一种未知的机制大大导致AVF衰竭。我们的研究旨在确定核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP 3）在慢性肾脏疾病条件下实验性AVF诱导的新生内膜形成中的作用。方法和结果从我们的发现来看，NLRP 3在尿毒症小鼠和患者的AVF内膜病变中上调。平滑肌特异性敲除NLRP 3小鼠表现出AVF s流出静脉新生内膜形成明显减少。与从对照小鼠分离的原代血管平滑肌细胞相比，从平滑肌特异性敲除NLRP3小鼠分离的细胞表现出增殖、迁移、表型转换、，激活单核巨噬细胞的能力减弱。为了确定NLRP 3的功能，使用了几种小分子抑制剂。结果表明，NLRP 3通过Smad2/3磷酸化而不是通过caspase-1/白介素-1信号传导调节平滑肌细胞增殖和迁移。出乎意料的是，选择性NLRP 3-炎性体抑制剂MCC 950也抑制Smad2/3磷酸化，缓解了非巨噬细胞依赖的慢性肾脏疾病引起的AVF衰竭。结论血管平滑肌细胞NLRP 3在尿毒症相关AVF衰竭中起着重要作用，可能是治疗AVF衰竭的一个有前景的靶点。

关键词：NLRP3；SMAD；动静脉瘘；慢性肾脏疾病。

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数字

图1
图1
NLRP公司3在CKD公司‐相关AVF公司失败。A类,高等教育人大隐静脉或闭塞静脉切片的染色AVF公司第条。B类,NLRP公司人类大隐静脉和闭塞静脉中的3种蛋白质水平AVF公司用Western blot分析测定s（每组4例）。量化显示在右侧。C类,高等教育假小鼠流出静脉染色或CKD公司小鼠3周后AVF公司结构。D类,执行副总裁假小鼠流出静脉（左侧）染色或CKD公司小鼠3周后AVF公司结构。内膜增生的严重程度通过新生内膜/管腔比率进行量化（n=6/组，右）。E类，免疫荧光染色美国有线电视新闻网1（绿色）和PCNA公司（红色）在假小鼠流出静脉中进行，或CKD公司小鼠3周后AVF公司结构。F类，计数（左）和比例（右）PCNA公司‐积极VSMC公司计算s。G公司,NLRP公司三 信使核糖核酸通过以下方法测量表达定量PCR在流出静脉中AVF公司来自假冒产品或CKD公司老鼠；对照组为对侧颈静脉（每组每个时间点n=4）。比例尺：100μm*P（P）<0.05; ns，无统计学意义；数据由非配对人员分析t吨测试。AVF公司指动静脉瘘；CKD公司慢性肾脏疾病；美国有线电视新闻网1，钙调素1；执行副总裁Elastica van Gieson；高等教育，苏木精和伊红；信使核糖核酸，信使核糖核酸;NLRP公司3，核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3；PCNA公司增殖细胞核抗原；定量PCR，定量实时聚合酶链式反应；VSMC公司，血管平滑肌细胞。
图2
图2
VSMC公司s快递NLRP公司3例由AVF公司.A类，α‐的免疫荧光染色座椅模块组件（绿色）带NLRP公司3（红色）（左侧）和美国有线电视新闻网1（绿色），带NLRP公司执行3（红色）（右侧）以确定NLRP公司3闭塞段定位AVF公司人类和CKD公司小鼠2周后AVF公司创造；正常人大隐静脉和对侧完整颈静脉CKD公司小鼠作为对照。B类，免疫荧光染色光盘68（绿色），带NLRP公司3（红色）也用于确定NLRP公司3闭塞段定位AVF公司人类和CKD公司小鼠2周后AVF公司创造。C类，α‐的蛋白质印迹分析座椅模块组件,标准时间22α和OPN公司人大隐静脉和闭塞静脉的蛋白质水平AVF公司（每组4人）。量化显示在底部。D类,信使核糖核酸α的表达水平‐座椅模块组件,标准时间22α、 和OPN公司在假小鼠流出静脉中或CKD公司小鼠3周后AVF公司结构。E类，体外信使核糖核酸表达水平NLRP公司三原绕组侧VSMC公司s来自重量老鼠(VSMC公司在饥饿24小时和24小时后收获20%假小鼠血清或CKD公司小鼠血清刺激；VSMC公司未经刺激的s作为对照，通过定量PCR.F类，体外信使核糖核酸α的表达水平‐座椅模块组件,标准时间22α、 和OPN公司原绕组侧VSMC公司s来自重量老鼠(VSMC公司饥饿24小时后收获s，48小时收获20%假小鼠血清或CKD公司小鼠血清刺激；VSMC公司未经刺激的s作为对照，通过定量PCR.比例尺：20μm*P（P）<0.05; ns，无统计学意义；数据由非配对人员分析t吨测试。α‐座椅模块组件表示α-平滑肌肌动蛋白；AVF公司动静脉瘘；CKD公司慢性肾脏疾病；美国有线电视新闻网1，钙调素1；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；信使核糖核酸，信使核糖核酸;NLRP公司3，核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3；OPN公司，骨桥蛋白；定量PCR定量实时聚合酶链反应；标准时间22α，平滑肌蛋白22α；VSMC公司血管平滑肌细胞；野生型野生型。
图3
图3
平滑肌特异性缺失NLRP公司3减轻内膜增生。A类，示意图NLRP公司三 SMC公司击倒对手小鼠世代。B类，蛋白质印迹分析NLRP公司不同组织中的3种蛋白质水平NLRP公司三 飞行/飞行和NLRP公司三 SMC公司击倒对手老鼠。量化显示在右侧。C类,高等教育流出静脉的染色CKD公司 NLRP公司三 飞行/飞行和CKD公司 NLRP公司三 SMC公司击倒对手小鼠3周后AVF公司结构。D类,执行副总裁流出静脉染色（左）CKD公司 NLRP公司三 飞行/飞行和CKD公司 NLRP公司三 SMC公司击倒对手小鼠3周后AVF公司结构。内膜增生的严重程度通过新生内膜/管腔比率进行量化（每组n=5–6，右）。E类，免疫荧光染色美国有线电视新闻网1（绿色）和PCNA公司（红色）在流出静脉中进行CKD公司 NLRP公司三 飞行/飞行和CKD公司 NLRP公司三 SMC公司击倒对手小鼠3周后AVF公司结构。F类，计数（左）和比例（右）PCNA公司‐积极VSMC公司计算s。G公司, α‐座椅模块组件,标准时间22α、 以及OPN公司 信使核糖核酸通过以下方法测量表达定量PCR在流出的静脉中AVF公司s来自CKD公司 NLRP公司三 飞行/飞行和CKD公司 NLRP公司三 SMC公司击倒对手小鼠3周后AVF公司施工；对照组为对侧颈静脉（每组5～6支）。比例尺：100μm*P（P）<0.05; ns，无统计学意义；数据由非配对人员分析t吨测试。AVF公司指动静脉瘘；CKD公司，慢性肾脏疾病；美国有线电视新闻网1，钙调素1；执行副总裁Elastica van Gieson；高等教育苏木精和曙红；信使核糖核酸，信使核糖核酸;NLRP公司3，核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3；NLRP公司三 SMC公司击倒对手平滑肌特异性敲除核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3；OPN公司，骨桥蛋白；PCNA公司增殖细胞核抗原；定量PCR定量实时聚合酶链反应；标准时间22α，平滑肌蛋白22α；VSMC公司血管平滑肌细胞；α‐座椅模块组件，α-平滑肌肌动蛋白。
图4
图4
NLRP公司3缺陷抑制VSMC公司s增殖、迁移和表型转换。A类，免疫荧光染色Ki67（红色）以显示原代细胞的增殖VSMC公司s（左）来自NLRP公司三 飞行/飞行和NLRP公司三 SMC公司击倒对手饥饿24小时和48小时后20%的小鼠CKD公司血清或正常培养基刺激。Ki67阳性的比例VSMC公司s进行了计算（右侧）。B类,CCK公司‐8总数量的分析VSMC公司饥饿24小时后为s，48小时/96小时后为20%CKD公司血清或正常培养基刺激。C类，主要VSMC公司第s个，共s个NLRP公司三 飞行/飞行和NLRP公司三 SMC公司击倒对手将小鼠接种在Transwell培养皿上进行迁移分析。6小时后（左），细胞通过膜迁移固定。计算每个HPF的细胞数（右）。D类、Annexin V的流式细胞术分析/圆周率染色用于定量细胞凋亡VSMC公司s来自NLRP公司三 飞行/飞行和NLRP公司三 SMC公司击倒对手饥饿24小时和48小时后20%的小鼠CKD公司血清刺激。量化如右图所示。E类，α‐的Western blot分析座椅模块组件,标准时间22α，和OPN公司初级阶段的蛋白质水平VSMC公司s来自NLRP公司三 飞行/飞行和NLRP公司三 SMC公司击倒对手饥饿24小时和48小时后20%的小鼠CKD公司血清或正常培养基刺激。量化显示在右侧。比例尺：20μm*P（P）<0.05; ns，无统计学意义；数据通过单向分析方差分析(A类,B类,C类、和E类)或未成婚者t吨测试(D类). α‐座椅模块组件表示α-平滑肌肌动蛋白；方差分析方差分析；CCK公司‐8，细胞计数试剂盒‐8；CKD公司慢性肾脏疾病；HPF，高功率场；NLRP公司3，核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3；NLRP公司三 SMC公司击倒对手，平滑肌特异性敲除核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3；OD，光密度；OPN公司，骨桥蛋白；标准时间22α，平滑肌蛋白22α；VSMC公司，血管平滑肌细胞。
图5
图5
NLRP公司3缺陷减少了VSMC公司s和巨噬细胞。A类,信使核糖核酸表达水平伊利诺伊州‐1α,伊利诺伊州‐1β,伊利诺伊州‐6，变压器‐α、Ccl2、Cxcl12、和立方厘米1原绕组侧VSMC公司s来自NLRP公司三 飞行/飞行和NLRP公司三 SMC公司击倒对手饥饿24小时和48小时后20%的小鼠CKD公司血清刺激。B类，骨髓衍生单核细胞重量将小鼠接种在Transwell培养皿上进行迁移分析。主要VSMC公司s来自NLRP公司三 飞行/飞行和NLRP公司三 SMC公司击倒对手饥饿24小时和48小时后20%的小鼠CKD公司血清刺激被用作化学引诱剂。24小时后（左侧）固定通过膜迁移的细胞，并计算每个HPF的细胞数（右侧）。C类，主要VSMC公司s来自NLRP公司三 飞行/飞行或NLRP公司三 SMC公司击倒对手饥饿24小时和48小时后20%的小鼠CKD公司采集血清刺激物，然后注入重量小鼠腹腔注射。12小时后收集腹腔灌洗液进行流式细胞术。D类，巨噬细胞（F4/80+）的比例（左）和估计计数（右），MHC二期+)，B电池（F4/80−，MHC-II型+)和T细胞/中性粒细胞（F4/80−和MHC二期−）进行了计算。E类，通过表达MHC二期,光盘40，以及光盘80.量化显示在右侧。比例尺：20μm*P（P）<0.05; ns，无统计学意义；数据由非配对人员分析t吨测试。CCL公司2表示C-C基序趋化因子配体2；CKD公司慢性肾脏疾病；CX公司三氯1，C-X3-C基序趋化因子配体1；CXCL公司12，C-X-C基序趋化因子配体12；伊利诺伊州白细胞介素；Mac，巨噬细胞；mRNA、信使RNA；NLRP公司3，核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3；NLRP公司三 SMC公司击倒对手，平滑肌特异性敲除核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3；N/T、中性粒细胞或T细胞；PLF，腹腔灌洗液；肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子；VSMC公司血管平滑肌细胞；重量，野生型。
图6
图6
NLRP公司3个缺陷块VSMC公司表型转化SMAD公司2/3抑制。A类,阿斯克，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1，伊利诺伊州‐大隐静脉和闭塞静脉中的1β和Smad2/3蛋白水平AVF公司用Western blot分析测定s（每组4例）。量化显示在底部。B类，体外, 阿斯克，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1，伊利诺伊州‐初级阶段的1β蛋白水平VSMC公司s来自NLRP公司三 飞行/飞行和NLRP公司三 SMC公司击倒对手老鼠(VSMC公司饥饿24小时后收获s，48小时收获20%CKD公司用Western blot分析测定血清或正常培养基刺激）。量化显示在底部。C类初级中Smad2/3蛋白质水平VSMC公司s来自NLRP公司三 飞行/飞行和NLRP公司三 SMC公司击倒对手老鼠(VSMC公司饥饿24小时后收获s，48小时收获20%CKD公司用Western blot分析测定血清或正常培养基刺激）。量化显示在底部。D类，免疫荧光染色Ki67（红色）显示原代细胞增殖VSMC公司s（左）来自重量饥饿24小时和48小时后20%的小鼠CKD公司血清刺激电动机控制中心950（50μmol/L），VX公司‐765（20μmol/L），以及姐妹3（3μmol/L）。Ki67阳性的比例VSMC公司计算s（右）。E类，Transwell分析用于评估原代细胞的迁移VSMC公司s（左）来自重量小鼠在饥饿24小时和48小时后20%CKD公司血清刺激电动机控制中心950（50μmol/L），VX公司‐765（20μmol/L），以及西斯3（3μmol/L），计算每个HPF的细胞数（右）。比例尺：20μm*P（P）<0.05; ns，无统计学意义；数据由非配对人员分析t吨测试(A类,D类、和E类)或单向方差分析(B类和C类).阿斯克表示包含caspase募集域的适配器凋亡相关斑点样蛋白；AVF公司动静脉瘘；CKD公司慢性肾脏疾病；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；HPF，高功率场；伊利诺伊州白细胞介素；NLRP公司3，核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3；NLRP公司三 SMC公司击倒对手平滑肌特异性敲除核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3；VSMC公司血管平滑肌细胞；重量，野生型。
图7
图7
电动机控制中心950可减弱内膜增生非依赖性炎症细胞。A类,高等教育车辆处理和电动机控制中心950处理CKD重量小鼠3周后AVF公司结构。B类,执行副总裁车辆处理后流出静脉（左侧）的染色电动机控制中心950处理CKD重量小鼠3周后AVF公司结构。内膜增生的严重程度通过新生内膜/管腔比率进行量化（n=6/组，右）。C类，免疫荧光染色美国有线电视新闻网1（绿色）和PCNA公司（红色）在经溶媒治疗的流出静脉中进行电动机控制中心950处理CKD重量小鼠3周后AVF公司结构。D类，计数（左）和比例（右）PCNA公司‐积极VSMC公司计算s。E类, α‐座椅模块组件,标准时间22α,和OPN公司 信使核糖核酸通过以下方法测量表达定量PCR在流出的静脉中AVF公司s来自经过处理的车辆和电动机控制中心950处理CKD重量小鼠3周后AVF公司结构。F类,高等教育车辆处理和电动机控制中心950处理CKD重量小鼠在信用证3周后AVF公司结构。G公司,执行副总裁车辆处理后流出静脉（左侧）的染色电动机控制中心950处理CKD重量小鼠在信用证3周后AVF公司结构。内膜增生的严重程度通过新生内膜/管腔比率进行量化（每组n=5–6，右）。小时, α‐座椅模块组件,标准时间22α和OPN公司 信使核糖核酸通过以下方法测量表达定量PCR在流出的静脉中AVF公司来自车辆处理和电动机控制中心950处理CKD重量小鼠在信用证3周后AVF公司结构。比例尺：100μm*P（P）<0.05; ns，无统计学意义；数据由非配对人员分析t吨测试。α‐座椅模块组件表示α-平滑肌肌动蛋白；AVF公司动静脉瘘；CKD公司慢性肾脏疾病；美国有线电视新闻网1，钙调素1；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；电子伏特Elastica van Gieson；高等教育苏木精和曙红；信用证，氯膦酸盐脂质体；信使核糖核酸，信使核糖核酸;OPN公司，骨桥蛋白；PCNA公司，增殖细胞核抗原；定量PCR定量实时聚合酶链反应；标准时间22α，平滑肌蛋白22α；VSMC公司血管平滑肌细胞；重量，野生型。
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