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.2019年3月；33（3）：3420-3436。
doi:10.1096/fj.201800618RRR。 Epub 2018年12月21日。

microRNA-135b的低表达导致顺铂耐药和增殖的抑制，并通过MST1介导的MAPK信号通路诱导胃癌细胞凋亡

周杰（音译） 1, 陈青（音） 2
附属公司

microRNA-135b的低表达导致顺铂耐药和增殖的抑制，并通过MST1介导的MAPK信号通路诱导胃癌细胞凋亡

周杰（音译）等。 美国财务会计准则委员会J. 2019年3月.

摘要

胃癌已被列为全球第四大癌症相关死亡原因。由于其能够抑制靶基因的表达，microRNAs（miRNAs）被列为参与肿瘤形成和发展的关键因素之一。因此，本研究通过靶向哺乳动物ste20-like kinase 1（MST1）的MAPK信号通路，研究microRNA-135b（miR-135b）对GC细胞顺铂[顺铂（CDDP）]耐药性的影响。进行基于微阵列的基因表达分析，筛选与GC相关的差异表达基因。采用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化铵法测定GC细胞对CDDP的敏感性。利用生物信息学数据库和双荧光素酶报告基因分析检查MST1是否为miR-135b的直接靶基因。制备具有高CDDP抗性的GC细胞株，然后分别进行培养和转染，然后将转染细胞接种到裸鼠体内，然后用CDDP进行治疗，以确定miR-135b在GC进展中与MST1相关的潜在机制和功能。这些结果高度表明了MST1在GC发展中的关键作用以及GC对CDDP的敏感性。miR-135b被发现调节MST1，进而影响GC的发展。观察到MKN28对CDDP最敏感，而MKN45对CDDP的敏感性最差。此外，miR-135b的下调导致MAPK信号通路失活；增加MST1和Bax的表达；降低p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-糖蛋白、p38MAPK、ERK1/2和多药耐药蛋白1、多药耐药相关蛋白1、肺耐药相关蛋白和Bcl-2的表达，从而抑制GC细胞的CDDP耐药。miR-135b的下调也抑制细胞增殖并诱导GC细胞凋亡。总之，本研究的结果表明，miR-135b的下调诱导了细胞凋亡，并通过失活MAPK信号通路和增加MST1的表达来抑制GC细胞的增殖和CDDP耐药性。微小RNA-135b的低表达导致顺铂耐药性和增殖的抑制，并通过MST1介导的MAPK信号通路诱导胃癌细胞凋亡。

关键词：CDDP；MKN28；MKN45；miR-135b。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者感谢审稿人对本文的有益评论。本研究得到了国家自然科学基金（81572985、81371508和31000471）的资助。作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
GEO数据分析和miRNA预测表明，miR-135b通过靶向MST1的MAPK信号通路影响GC的进展。A–D)数据库分析的4个结果中的基因表达热图[GSE13861(A类)，GSE19826(B类)，GSE49051(C类)和GSE79973(D类)]. 横坐标表示样本数，纵坐标表示DEG的名称，右上直方图表示颜色分级（从上到下的颜色变化表示芯片表达式数据从大到小的值）。在图中，每个矩形对应一个样本表达值，每列代表每个样本中所有基因的表达，左边的树状图是不同样本中不同基因的聚类分析结果，顶栏是样本类型，右上框表示样本颜色参考（正常对照样本为蓝色，肿瘤样本为红色）。E类)蓝色部分表示GSE13861中选择的基因编号，红色部分表示GSE 19826中选择的DEG，绿色部分表示GSE49051中的选择基因，黄色部分表示GSE79973中的选择DEG，四个数据集的交集为MST1。F类)MST1基因在GSE31811中的表达。横坐标是样本类型，纵坐标是基因名称和所选数据集名称，灰色框表示CDDP无效治疗中的基因表达，绿色框表示CDDP+有效治疗P（P）值位于地图的左上角。G公司)在TargetScan、mirDIP和microRNA.org数据库中介导MST1的miRNA的预测结果。通过对GC-miRNA数据集GSE26595的分析，获得了4组的交集。蓝色表示TargetScan数据库的预测结果，红色表示mirDIP数据库的预测结论，绿色表示microRNA.org数据库的预测成果，红色对应GSE26595数据库，4组的交集为hsa-miR-135b。H（H）)hsa-miR-135b在GSE30070中的表达。横坐标是样本类型，纵坐标是基因名称和所选数据集，灰色框是指正常对照组中hsa-miR-135b的表达，绿色框是指GC组中hsa-miR-135b的表达。两个样本之间的miRNA表达水平差异显著P（P）图左上角的值。
图1
图1
GEO数据分析和miRNA预测表明，miR-135b通过靶向MST1的MAPK信号通路影响GC的进展。A–D)数据库分析的4个结果中的基因表达热图[GSE13861(A类)，GSE19826(B类)，GSE49051(C类)和GSE79973(D类)]. 横坐标表示样本数，纵坐标表示DEG的名称，右上直方图表示颜色分级（从上到下的颜色变化表示芯片表达式数据从大到小的值）。在图中，每个矩形对应一个样本表达值，每列代表每个样本中所有基因的表达，左边的树状图是不同样本中不同基因的聚类分析结果，顶栏是样本类型，右上框表示样本颜色的参考（蓝色用于正常对照样本，红色用于肿瘤样本）。E类)蓝色部分表示GSE13861中的选定基因编号，红色部分表示GSE19826中的选定DEG，绿色部分表示GSE49051中的选定基因，黄色部分表示GSE79973中的选定DEG，4个数据集的交集为MST1。F类)MST1基因在GSE31811。横坐标是样本类型，纵坐标是基因名称和所选数据集名称，灰色框表示CDDP无效治疗中的基因表达，绿色框表示CDDR有效治疗P（P）值位于地图的左上角。G公司)在TargetScan、mirDIP和microRNA.org数据库中介导MST1的miRNA的预测结果。通过对GC-miRNA数据集GSE26595的分析，获得了4组的交集。蓝色表示TargetScan数据库的预测结果，红色表示mirDIP数据库的预测结论，绿色表示microRNA.org数据库的预测成果，红色对应GSE26595数据库，4组的交集为hsa-miR-135b。H（H）)hsa-miR-135b在GSE30070中的表达。横坐标是样本类型，纵坐标是基因名称和所选数据集，灰色框是指正常对照组中hsa-miR-135b的表达，绿色框是指GC组中hsa-miR-135b的表达。两个样本之间的miRNA表达水平差异显著P（P）图左上角的值。
图2
图2
MTT分析结果表明，GC MKN28是对CDDP最敏感的细胞株，MKN45细胞株对CDDP的敏感性最低。A类)用0–100μg/ml CDDP处理各组的细胞增殖。B类)用1μg/ml CDDP处理各组细胞的敏感性差异。数据以平均值±表示标准偏差; 中的不同时间点A类采用重复测量ANOVA和B类采用单因素方差分析。实验重复3次*P（P）与MKN28细胞相比<0.05，#P（P）与MKN45细胞相比<0.05。
图3
图3
双荧光素酶报告试验和microRNA.org表明，MST1是MKN45和MKN28细胞中miR-135b的靶基因。A类)MST1 mRNA与miR-135b结合的3′-UTR区序列。B类)MKN45中MST1-野生型（Wt）和MST1-突变型（Mut）的荧光素酶活性。C类)MKN28中MST1-野生型（Wt）和MST1-突变型（Mut）的荧光素酶活性。荧光素酶活性结果表示为平均值±标准偏差，并使用Student’st吨测试。实验重复3次*P（P）与NC组相比<0.05。
图4
图4
qRT-PCR和Western blot分析的结果表明，miR-135b的过度表达抑制了MST1的mRNA和蛋白表达。A类)MKN45细胞中MST1的miR-135b表达和mRNA表达。B类)MST1在MKN45细胞中的蛋白表达。C类)MKN45细胞中MST1和β-肌动蛋白的蛋白带。D类)MKN28细胞中MST1的MiR-135b表达和mRNA表达。E类)MKN28细胞中MST1的蛋白表达。F类)MKN28细胞中MST1和β-肌动蛋白的蛋白带。转染后GC细胞系的表达表示为平均值±标准偏差，采用单因素方差分析对数据进行检测。实验重复3次*P（P）与NC组相比<0.05。
图5
图5
根据qRT-PCR和Western blot分析，miR-135b的过度表达激活了MAPK信号通路。A类)MAPK信号通路相关基因在MKN45细胞中的mRNA表达。B类)MAPK信号通路相关基因在MKN45细胞中的蛋白表达。C类)MKN45细胞中MAPK信号通路相关基因的蛋白带。D类)MAPK信号通路相关基因在MKN28细胞中的mRNA表达。E类)MAPK信号通路相关基因在MKN28细胞中的蛋白表达。F类)MKN28细胞中MAPK信号通路相关基因的蛋白带。转染后GC细胞系的表达表示为平均值±标准偏差，采用单因素方差分析对数据进行检测。实验重复3次*P（P）与NC组相比<0.05。
图6
图6
流式细胞术结果显示，miR-135b表达降低可诱导MKN28细胞和MKN45细胞凋亡。A类)转染后MKN45细胞凋亡相关因子的mRNA表达。B类)转染后MKN45细胞凋亡相关因子的蛋白表达。C类)转染后MKN45细胞凋亡相关因子的蛋白带。D类)MKN45细胞的细胞周期。E类)MKN45细胞凋亡。F类)转染后MKN28细胞凋亡相关因子的mRNA表达。G公司)转染后MKN28细胞凋亡相关因子的蛋白表达。H（H）)转染后MKN28细胞凋亡相关因子的蛋白带。我)MKN28细胞的细胞周期。J型)MKN28细胞凋亡。转染后GC细胞中凋亡相关因子、细胞周期和细胞凋亡的表达数据表示为平均值±sd中，并通过使用单向方差分析来检测数据。实验重复3次*P（P）与NC组相比<0.05。
图6
图6
流式细胞术结果显示，miR-135b表达降低可诱导MKN28细胞和MKN45细胞凋亡。A类)转染后MKN45细胞凋亡相关因子的mRNA表达。B类)转染后MKN45细胞凋亡相关因子的蛋白表达。C类)转染后MKN45细胞凋亡相关因子的蛋白带。D类)MKN45细胞的细胞周期。E类)MKN45细胞凋亡。F类)转染后MKN28细胞凋亡相关因子的mRNA表达。G公司)转染后MKN28细胞凋亡相关因子的蛋白表达。H（H）)转染后MKN28细胞凋亡相关因子的蛋白带。我)MKN28细胞的细胞周期。J型)MKN28细胞凋亡。转染后GC细胞中凋亡相关因子、细胞周期和细胞凋亡的表达数据表示为平均值±标准偏差，采用单因素方差分析对数据进行检测。实验重复3次*P（P）与NC组相比<0.05。
图7
图7
根据MTT分析，下调miR-135b抑制MKN28细胞和MKN45细胞的细胞增殖。A类)MKN45细胞增殖。B类)MKN28细胞增殖。各组GC细胞转染后的增殖活性表示为平均值±标准偏差，并用重复测量方差分析进行不同时间点之间的比较。实验重复3次*P（P）与NC组相比<0.05。
图8
图8
qRT-PCR和Western blot分析结果表明，CDDP处理后，MKN45和MKN28细胞中MST1表达增加。A类)MST1的蛋白表达。B类)MST1的mRNA表达。C类)MST1和β-肌动蛋白的蛋白禁令。MST1的表达以平均值±标准偏差，并使用Student的t吨测试。实验重复3次*P（P）与同源亲本细胞相比<0.05，#P（P）与MKN28/CDDP相比，<0.05。
图9
图9
qRT-PCR、Western blot分析和MTT分析的结果评估了miR-135b的表达降低，进一步揭示了MDR1、MRP1、LRP和p-GP的表达降低以及细胞对CDDP的耐药性降低。A类)MKN45细胞耐药基因的mRNA表达。B类)转染MKN45细胞后耐药基因的蛋白表达。C类)集成电路50各组MKN45细胞转染后的值。D类)转染MKN45细胞后耐药基因的蛋白带。E类)MKN28细胞耐药基因的mRNA表达。F类)转染MKN28细胞后耐药基因的蛋白表达。G公司)集成电路50各组MKN28细胞转染后的值。H（H）)转染MKN28细胞后耐药基因的蛋白带。转染后GC细胞相关耐药基因的表达与IC50表示为平均值±标准偏差，采用单因素方差分析对数据进行检测。实验重复3次*P（P）与NC组相比<0.05。
图10
图10
根据Western blot分析和qRT-PCR的结果，MiR-135b下调导致MST1蛋白表达增加，并抑制细胞CDDP抵抗。A类)肿瘤大小。B类)各组转染后CDDP处理的肿瘤体积。C类)各组转染后CDDP治疗的肿瘤重量。D类)miR-135b的表达体内在各组转染后。E类)MST1的表达体内在各组转染后。F类)MST1蛋白带体内在各组转染后。裸鼠肿瘤的大小、体积和重量以及miR-135b和MST1的表达均表示为平均值±标准偏差采用单因素方差分析比较多组之间的数据，并采用重复测量方差分析比较不同时间点之间的数据。实验重复3次*P（P）与NC组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。
图11
图11
苏木精和伊红染色强烈表明，miR-135b降低和MST1增加刺激CDDP诱导的GC细胞凋亡（×400）。比例尺，25µm。
图12
图12
机制图显示，下调miR-135b通过失活MAPK信号通路和增加MST1的表达，诱导GC细胞凋亡，抑制GC细胞增殖和CDDP抵抗。
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