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.2018年12月6日12:477。
doi:10.3389/fncel.2018.00477。 2018年eCollection。

体内光遗传学方法研究小鼠幼鼠神经元与少突胶质细胞的相互作用

多米齐亚娜·奥托拉尼 1 2, 布兰丁庄园-帆船 1 2, 大卫·奥杜斯 2, 费尔南多·奥尔蒂斯 2 三, 玛丽亚·塞西莉亚·安古洛 1 2
附属公司

体内光遗传学方法研究小鼠幼鼠神经元与少突胶质细胞的相互作用

多米齐亚娜·奥托拉尼等。 前细胞神经科学. .

摘要

在行为正常的幼年和成年小鼠中，光遗传学和药物遗传学技术已经有效地分析了神经元活性在控制少突胶质谱系细胞中的作用。这类研究在出生后早期（PN）发育期间也引起了高度关注，因为在PN的前两周，少突胶质细胞动力学发生了重要变化。然而，由于新生小鼠的高水平特异性蛋白表达不太可靠，因此很难在早期实施神经元操作。在这里，我们描述了一种允许对清醒小鼠幼鼠的神经元进行光遗传刺激的方案，目的是研究早期PN阶段神经元活动对少突胶质细胞动力学的影响。由于GABA能中间神经元通过真诚地在大脑皮层发育过程中，突触与这些前体细胞保持密切关系，我们利用这一神经元-少突胶质相互作用的相关示例来实现一种证明原理的光遗传学方法。首先，我们测试了Nkx2.1-Cre和Parvalbumin（PV）-Cre系，以驱动不同发育阶段中间神经元亚群中光敏离子通道视紫红质-2（ChR2）的表达。通过对急性体感皮层切片中ChR2阳性中间神经元的斑贴灯记录和光刺激，我们分析了这些神经元中ChR2的功能表达水平。我们发现，在PN第10天（PN10），PV-Cre小鼠的ChR2表达不足，该通道需要从胚胎期开始表达（如Nkx2.1-Cre系），以便在小鼠幼崽中实现可靠的光激活。然后，我们实施了立体定向手术，在皮层表面放置一根微型光纤，以对PN10处的ChR2阳性中间神经元进行光刺激。体内在第五层记录场电位，以验证光刺激到达皮层深层。最后，我们通过常规免疫染色分析了光刺激对V层少突胶质细胞种群的影响。OPC的总密度和增殖分数均不受中间神经元活性增加的影响体内，补充了先前显示GABA能突触活性对OPC增殖缺乏影响的研究结果。这里描述的方法应该为未来研究PN脑成熟过程中早期细胞相互作用的作用提供一个框架。

关键词：GABA能中间神经元；发育脑；少突胶质前体细胞；光遗传学；增殖；躯体感觉皮层。

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数字

图1
图1
手术体内对幼鼠体感皮层中间神经元的光遗传刺激。（A）图中显示了一只麻醉的PN10小鼠，它将植入物固定在立体定向装置中。在放置微型光纤之前，头盖骨上覆盖了两层胶水。在这个例子中，动物的皮肤被切割得更宽，以便在图片上看到。（B）在体感皮层表面植入微型光纤的方案。（C）Nkx2.1的桶状皮层的I至VI层（左侧；低放大率）和V层（右侧；左侧白色正方形的高放大率）中表达ChR2的中间神经元的共聚焦图像Cre公司：ChR2-YFP洛克斯/+PN10处的鼠标。YFP报告者检测到Nkx2.1启动子驱动的ChR2表达（绿色）。箭头表示灌注后移除幼崽的光纤时产生的小损伤。它可以让我们精确地定位微型光纤的位置。
图2
图2
PN10 Nkx2.1中表达ChR2-的FSI和NFSI的光活化Cre公司：ChR2 YFP洛克斯/+大脑切片中的老鼠幼崽。（A1、B1）FSI的电流灯记录（A1）和NFSI（B1）在PN10皮质层V中表达ChR2。注意两个细胞在800 ms去极化和超极化步骤（底部方形脉冲）下的放电特性差异。（A2、B2）相同的FSI（A2）和NFSI（B2）用10ms不同频率的光脉冲在30s内进行光刺激（蓝色条）。（C、D）PN10下FSI（黑色）和NFSI（灰色）在不同光刺激频率下用光列激发动作电位的平均成功百分比（C）和PN21（D）.∗第页< 0.05;∗∗第页< 0.01; 和∗∗∗第页<0.001，用于每个中间神经元亚型的比较，Kruskal–Wallis试验，然后是Dunn试验事后（post-hoc）测试；无显著差异(第页>0.05）未显示每个频率的FSI和NFSI之间；Mann–Whitney测试。
图3
图3
PN10脑切片在高频光刺激下的反应失败并不是由于中间神经元未成熟膜的特性。（A）在50Hz光刺激方案中以电流灯模式记录的已识别的ChR2-表达中间神经元（A1）在第10页的脑切片中。注意蓝光脉冲（蓝色条）导致的众多故障（插图）。电流注入刺激相同的神经元（400 pA，10 ms；（A2）)在50Hz时几乎没有显示故障（插图）。（B）PN10小鼠FSI和NFSI在50 Hz下光刺激与电流刺激成功率的比较。（C）在50Hz光刺激方案中以电流灯模式记录的已识别的ChR2-表达中间神经元（C1）在PN21的脑切片中。注意，与PN10处的中间神经元相比，光激活（蓝色条）触发的AP（插图）数量增加（A1）电流注入刺激相同的神经元（400 pA，10 ms；指挥与控制)50 Hz时几乎没有故障（插图）。（D）PN21小鼠FSI和NFSI在50 Hz下光刺激与电流刺激成功率的比较。∗∗第页<0.01和∗∗∗第页<0.001，Mann–Whitney检验。
图4
图4
PV中FSI的光生刺激Cre公司：ChR2-YFP洛克斯/洛克斯小鼠出生后大脑皮层发育过程中的脑切片。（A）PN10、PN20和PN26小鼠低（左）和高（右）放大率下表达ChR2（YFP，绿色）和PV蛋白（红色）的皮层中间神经元的共焦图像。注意，与晚年更明亮、更广泛的膜表达相比，PN10处YFP的细胞质表达较弱。（B）层V ChR2-表达FSI的电流灯记录（B1）在PN10。显示了去极化和超极化步骤（底部方形脉冲）。该神经元中的10 Hz光刺激序列（蓝色脉冲）未诱发动作电位(地下一层右图，插图），但光激活诱导的反应在发育过程中增加(B2、B3，右侧）。请注意，PN26处表达FSI的第V层ChR2的光激活（蓝色脉冲）会诱发动作电位，以响应每个光脉冲（B3右侧，插图）。（C）PV中PN19-22和PN26从10 Hz到50 Hz的轻轨传输成功激发动作电位的平均百分比Cre公司：ChR2-YFP洛克斯/洛克斯老鼠。∗第页< 0.05;∗∗第页<0.01，Kruskal–Wallis测试，然后是Dunn测试事后（post-hoc）测试；无显著差异(第页>0.05）在FSI和NFSI之间，未显示每个频率。
图5
图5
PN10小鼠幼鼠脑切片中的光激发LFP和体内.（A）在光刺激过程中，用位于记录部位正上方的光纤在脑切片的皮层V层进行细胞外记录（A1）.光刺激诱发的LFP(A2类，蓝线）在表达ChR2的转基因小鼠（Cre+/-). 谷氨酸能和γ-氨基丁酸能拮抗剂（50μM APV，10μM NBQX，10μM SR95531；A2类红色痕迹）和TTX（1μM，A2类灰色痕迹）。DIC：差分干涉对比度图像。（B） 体内通过放置一个定制的optrode，该optrode包含一根微型光纤和一根50μm Ni/Ag导线，对皮层第V层进行细胞外记录（B1）.体内通过光刺激成功诱发LFP(地下二层，蓝线）在表达ChR2的转基因小鼠（Cre）中超过1.5 mW的光功率+/-). 报告的功率为1.5至4 mW，对应于连续波（CW）模式下测量得到的每脉冲功率。Cre中未诱发任何反应-/-控制鼠标。
图6
图6
这个体内P10处第V层皮层中间神经元的光激活不会改变少突胶质细胞密度。（A）光刺激协议的实验设计。小鼠注射EdU（50 mg/kg），然后在3小时内进行光刺激。（B）光刺激后Olig2（绿色）、CC1（红色）和EdU（洋红色）细胞染色。奥利格2+/CC1号机组-OPC显示在第一个面板中（箭头、插图）。只有少数Olig2+/CC1号机组+在这个年龄段发现了OL（第二个面板中的箭头，插图）。注意，并非所有EdU染色的细胞都是Olig2+单元格（最后两个面板中的箭头）。（C）总少突胶质细胞密度（lig2+)、OPC（Olig2+/CC1号机组-)、差异化OLs（Olig2+/CC1号机组+)，总增殖细胞（EdU+)和增殖性OPC（Edu+/奥利格2+/CC1号机组-)在三种测试条件下。在任何比较中均未发现显著差异(第页>0.05，Kruskal–Wallis测试，然后是Dunn’s事后（post-hoc）测试）。
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    1. 阿斯顿·琼斯（Aston-Jones G.）、戴瑟罗（Deisserath K.）（2013年）。光遗传学和药物遗传学的最新进展。《大脑研究》1511 1-5。10.1016/j.braines.2013.01.026-内政部-项目管理咨询公司-公共医学