Luminex-based quantification of Alzheimer's disease neuropathologic change in formalin-fixed post-mortem human brain tissue

doi:10.1038/s41374-018-0165-x

.2019年7月；99(7):1056-1067.

doi:10.1038/s41374-018-0165-x。 Epub 2018年12月20日。

基于Luminex的阿尔茨海默病死后福尔马林固定人脑组织神经病理学变化定量

C德克·基恩¹, 安吉拉·威尔逊¹, 米切尔·D·基尔戈尔¹, 劳伦·布鲁纳¹, 娜迪娅·波苏普纳（Nadia O Postupna）¹, 马丁·达瓦斯²

附属公司

¹华盛顿大学病理学系，西雅图，华盛顿州，98104，美国。
²华盛顿大学病理学系，西雅图，华盛顿州，98104，美国。mdarvas@uw.edu。

PMID： 30573871
预防性维修识别码：第586549页
内政部： 10.1038/s41374-018-0165-x

基于Luminex的阿尔茨海默病死后福尔马林固定人脑组织神经病理学变化定量

C德克·基恩等。实验室投资. 2019年7月.

.2019年7月；99(7):1056-1067.

doi:10.1038/s41374-018-0165-x。 Epub 2018年12月20日。

作者

C德克·基恩¹, 安吉拉·威尔逊¹, 米切尔·D·基尔戈尔¹, 劳伦·布鲁纳¹, 娜迪娅·波苏普纳（Nadia O Postupna）¹, 马丁·达瓦斯²

附属公司

¹华盛顿大学病理学系，西雅图，华盛顿州，98104，美国。
²华盛顿大学病理学系，西雅图，华盛顿州，98104，美国。mdarvas@uw.edu。

PMID： 30573871
预防性维修识别码： PMC6586549型
内政部： 10.1038/s41374-018-0165-x

摘要

绝大多数存档的研究和临床病理标本以福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的形式保存，但与新鲜冷冻组织样品不同，FFPE组织的高度定量测量仅限于免疫组织化学和免疫荧光阈值图像分析研究、细胞计数、，和顺序排序系统。这对旨在将阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病的诊断标志物与年龄、性别、药物暴露、基因型、疾病分期、共病性或环境因素等参数相关联的临床研究构成了重大障碍。为了克服这一局限性，我们开发了基于Luminex的技术和协议，用于定量FFPE脑切片中的淀粉样β和过度磷酸化Tau。我们验证了30例患者的前额叶皮层、海马和新纹状体FFPE切片中的Luminex分析，这些患者按照NIA-AA对AD的当前建议进行了先前的AD神经病理学诊断评估：10例被诊断为非AD或AD低，10例被诊为中度AD，10例为AD高神经病理学改变。与神经病理学评估一致，Luminex分析在AD神经病变程度高的患者的额叶皮层和纹状体中检测到大量淀粉样β蛋白，在额叶皮层及海马中检测到了大量高磷酸化Tau蛋白。正如我们在这里用IBA1和GFAP所示，这种分析可以扩展到检测各种感兴趣的抗原靶点。这一新方法支持多重高定量、分子特异性神经病理学测量，以进一步探索AD神经变性的机制。

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作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
重组Aβ42标准品的验证。**（a）**使用商业Innogenetics试剂盒标准和Innogenitics试剂盒定量重组Aβ42。**（b）**使用Innogenetics试剂盒测量的Innogenitics试剂盒和重组Aβ42标准品系列稀释液的比较。**（c）**使用重组aβ42标准物生成标准曲线，用我们新开发的Luminex分析法测量。**（d）**使用我们最新开发的Luminex分析测定的系列稀释重组Aβ42标准品的测试-再测试。所有数据均以平均值±SEM表示。

**图2。**
确定用于Luminex分析Aβ42的最佳FFPE样本量，并量化NIA-AA AD严重程度为非/低、中、高的患者FFPE组织中的Aβ42。**（a）**Aβ42的荧光强度信号是额中回胍可溶性提取物数量增加的函数。**（b）**不同NIA-AA AD严重程度患者MFG样本中的Aβ42水平（非/低：n=10，中：n=110，高：n=9）。**（c）**不同NIA-AA AD严重程度患者海马样本中的Aβ42水平（非/低：n=10，中：n=110，高：n=9）。**（d）**不同NIA-AA AD严重程度患者新纹状体样本中的Aβ42水平（非/低：n=10，中：n=110，高：n=9）。面板中的Aβ42水平**（b-d）**归一化为胍可溶蛋白的量（pg/μg）。所有数据均以平均值±SEM表示。★ p<0.05和★★ p<0.01。

**图3。**
确定用于pTau Luminex分析的最佳FFPE样本量，并量化NIA-AA AD严重程度为非/低、中、高的患者FFPE组织中的pTau。**（a）**pTau的荧光强度信号与额叶中回RIPA可溶性提取物数量增加有关。**（b）**不同NIA-AA AD严重程度病例的MFG样本中的pTau水平（非/低：n=10，中等：n=10，高：n=9）。**（c）**NIA-AA AD严重程度不同的患者海马样本中的pTau水平（非/低：n=10，中：n=110，高：n=9）。**（d）**不同NIA-AA AD严重程度患者新纹状体样本中的pTau水平（非/低：n=10，中：n=110，高：n=9）。面板中的pTau水平**（b-d）**归一化为RIPA可溶性蛋白的量（每μg荧光强度）。所有数据均以平均值±SEM表示。★ p<0.05和★★ p<0.01。

**图4。**
MFG、海马和新纹状体中Aβ42和pTau的Luminex荧光信号强度散点图。我们对所有分析的大脑区域的Aβ42和pTau信号进行了相关分析，并证实了以下具有统计学意义的正相关。**（a）**MFG中Aβ42的水平与海马中Aβ42。**（b）**MFG中的Aβ42水平与新纹状体中的Aβ42水平。**（c）**海马Aβ42水平与新纹状体Aβ42的水平。**（d）**新纹状体中Aβ42水平与MFG中pTau水平的比较。**（e）**MFG中的pTau水平与海马中的pTau水平。统计显著性R²值显示在每个散点图中。

**图5。**
Aβ42和pTau水平与AD遗传风险的关系。**（a）**Aβ42和**（b）**无脑卒中患者MFG、海马和新纹状体pTau水平*APOE-ε4*等位基因（n=18）和至少一个*APOE-ε4*等位基因（n=11）。所有数据均以平均值±SEM表示。

**图6。**
GFAP和IBA1的Luminex分析。**（a）**使用商业GFAP标准生成标准曲线。**（b）**使用商业IBA1标准生成标准曲线。**（c）**GFAP荧光强度信号用于增加FFPE额叶中回提取物的数量。**（d）**IBA1荧光强度信号用于增加FFPE额中回提取物的量。所有提取均采用商用Qiagen FFPE试剂盒进行，提取的蛋白质在RIPA缓冲液中重新悬浮。所有荧光强度都是用我们新开发的Luminex分析法测量的。

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