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.2018年12月18日；25（12）：3315-3328.e6。
doi:10.1016/j.celrep.2018.11.080。

Wars2突变小鼠模型显示OXPHOS缺乏和组织特异性应激反应途径激活

托马斯·阿格纽 1, 米歇尔·戈德斯沃西 1, 卡洛斯·阿吉拉尔 1, 毛安娜 1, 米歇尔·西蒙 1, 海伦·希尔顿 1, 克里斯·埃萨帕 1, 吴宜兴 1, 希瑟·卡特 1, 利兹·本特利 1, 谢丽尔·斯库达摩尔 1, 乔安娜·鲍尔顿 2, 卡尔·J·莫顿 2, 凯尔·汤普森 三, 郎平河 三, 史蒂夫·D·M·布朗 1, 罗伯特·泰勒 三, 迈克尔·鲍尔 4, 罗杰·D·考克斯 5
附属机构

Wars2突变小鼠模型显示OXPHOS缺乏和组织特异性应激反应途径激活

托马斯·阿格纽等。 单元格代表. .

摘要

线粒体功能所必需的基因突变具有多效性效应。这些特征背后的机制为代谢内稳态和潜在治疗提供了见解。在这里，我们报道了一种含有色氨酸-tRNA合成酶2（Wars2）基因突变的小鼠模型的特征，该基因编码线粒体定位的Wars2蛋白。这种低形态等位基因导致进行性组织特异性病变，包括听力损失、脂肪减少、脂肪组织功能障碍和肥厚性心肌病。我们证明，组织异质性是由于综合应激反应（ISR）通路的可变激活和某些组织对受损线粒体翻译的反应能力所致。在某些组织中ISR激活后，许多全身代谢效应可能通过升高的成纤维细胞生长因子21（FGF21）介导。这些发现证明了与患者Wars2突变相关的潜在多效性。

关键词：情报、监视与侦察；WARS2；肥胖；耳聋；肥厚性心肌病；线粒体功能障碍；多效性的。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
使用听觉脑干反应（ABR）测定（A）1个月龄、（B）3个月龄和（C）6个月龄，（D）10个月龄以及（E）12个月龄时的ABR表型最小听觉检测阈值（分贝声压级，dB SPL）。战争2V117L/V117L,战争2V117L型/+、和战争2+/+窝友数量（雄性和雌性混合）分别为（A）5、2和4；（B） 15、19和15；（C） 19、19和22；（D） 9、11和7；和（E）分别为7、10和7；平均值±扫描电镜（SEM）。显著性通过单因素方差分析（ANOVA）-Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验确定。重要性介于战争2V117L/V117L和战争2+/+和之间战争2+/V117L型和战争2+/+显示为∗和#p<0.05，∗∗和#p<0.01，***和###p<0.001，以及∗∗∗∗和####p分别<0.0001。战争2V117L/V117L老鼠是蓝色方块，战争2V117L型/+老鼠是红圈战争2+/+老鼠是黑色三角形。另请参见图S1–S3和表S1。
图2
图2
战争2V117L/V117L因肥胖减少而减轻体重的小鼠雄性和雌性队列1小鼠：（A和D）体重，（B和E）脂肪质量，（C和F）瘦质量。战争2V117L/V117L,战争2V117L型/+、和战争2+/+产仔数分别为7和8，13和17-21，11和3只雄性和雌性；平均值±标准差。男性曲线下面积（AUCs）采用普通单向方差分析与Tukey多重比较试验进行比较，女性曲线下面积采用单向方差分析非参数Kruskal-Wallis试验和Dunn多重比较测试进行比较。对于AUC战争2+/+和战争2V117L/V117L,战争2+/V117L型和战争2V117L/V117L、和战争2+/+和战争2V117L型/+男性体重p<0.0001，p=0.0002，p>0.5057；脂肪质量分别为p＜0.0001、p＜0.0001和p＝0.6505；瘦质量为p=0.0063，p=0.0008，p=0.5314。女性体重战争2+/V117L型和战争2V117L/V117Lp<0.0001，脂肪质量p=0.0001，瘦肉质量p=0.0055（未显示野生型[WT]比较，因为n=3）。采用单因素方差分析非参数Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验计算特定时间点的显著性。重要性介于战争2+/+和战争2V117L/V117L和之间战争2+/V117L型和战争2V117L/V117L显示为∗和#p<0.05，∗∗和#p<0.01，以及***和p<0.001。战争2V117L/V117L老鼠是蓝色方块，战争2V117L型/+老鼠是红圈战争2+/+老鼠是黑色三角形。另请参见图S4。
图3
图3
这个战争2V117L型等位基因导致肥厚性心肌病（A）6个月龄雄性小鼠的器官重量除以体重。战争2V117L/V117L和战争2+/+动物数量分别为3只和3只；采用Holm-Sidak方法对数据进行多重t检验。（B） 男性左心室的典型超声心动图战争2V117L/V117L和战争2+/+6个月大的小鼠。（C） 对左心室前壁（LVAW）直径、左心室（LV）质量、卒中体积（SV）和心输出量（CO）的图像进行功能分析。战争2V117L/V117L和战争2+/+雄性小鼠动物数分别为6只和5只；平均值±标准差。数据采用普通单向方差分析和Tukey事后检验进行分析，以纠正多重比较。（D） 超声心动图分析战争2V117L型/−6个月大的雄性小鼠。战争2V117L型/−,战争2V117L型/+,战争2+/负极和战争2+/+动物数量分别为3只、5只、5只和5只；平均值±标准差。数据采用普通单向方差分析和Tukey事后检验进行分析，以纠正多重比较。∗p<0.05，∗∗p<0.01，***p<0.001。战争2V117L/V117L老鼠是蓝色方块，战争2+/+老鼠是黑色三角形，战争2V117L型/+小鼠为红色圆圈，复合杂合子战争2V117L型/−老鼠是棕色填充的蓝色方块战争2+/负极老鼠是棕色的圆圈。
图4
图4
战争2V117L型等位基因增加外显子跳跃，导致组织特异性WARS2（战争2）线粒体呼吸链缺陷（A）战争2c.349G>T NetGene2拼接位点预测。（B） 耳蜗RNA提取的RT-PCR战争2+/+,战争2V117L型/+、和战争2V117L/V117L小鼠使用设计为外显子1和5的寡核苷酸引物对。对产品进行测序，并包含所示的外显子。（C） 量化战争2mRNA错误拼接体内，从12个月大的小鼠组织中提取RNA，并使用3个靶向替代的TaqMan探针进行qRT-PCR战争2外显子-外显子边界战争2+/+：边界2/3（战争2佛罗里达州)，4/5（战争2总计)和5/6(战争2总计).战争2v117升/v117升和战争2+/+产仔数分别为8只和8只（雄性5只，雌性3只）；平均值±SEM。数据采用Mann-Whitney双尾t检验进行分析。之间的显著差异战争2V117L/V117L和战争2+/+示例如下所示∗p<0.05，∗∗p<0.01，以及***p<0.001。（D–J）免疫印迹分析12个月龄雌性小鼠多组织中（D）WARS2蛋白水平和（E–J）线粒体呼吸链亚单位蛋白水平（E）心脏、（F）肝脏、（G）棕色脂肪组织（BAT）、（H）肾脏、（I）腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和（J）骨骼肌。战争2V117L/V117L和战争2+/+窝卵数分别为3和3。另请参见图S5。
图5
图5
战争2V117L/V117L小鼠出现WAT褐变和BAT功能障碍（A–C）。雄性小鼠12个月大时脂肪组织仓库H&E染色切片的代表性图像。（A） Gonadal WAT（gWAT）、（B）iWAT和（C）BAT。比例尺，100μm。战争2v117升/v117升和战争2+/+动物数量分别为3只和3只。（D） 12个月龄雄性小鼠iWAT中褐变标记的相对mRNA表达分析。战争2V117L/V117L和战争2+/+动物数量分别为5只和5只；平均值±标准偏差。数据采用非配对双尾t检验进行对数转换和分析，标准偏差相等。∗p<0.05，∗∗p＜0.01，***p<0.001。（E） 12个月龄雌性小鼠iWAT中的相对UCP1蛋白水平。战争2v117升/v117升和战争2+/+动物数量分别为3只和3只；平均值±标准偏差。数据采用非配对t检验进行分析。∗p<0.05。（F） 12月龄雄性小鼠BAT中褐变标记的相对mRNA表达分析。战争2V117L/V117L和战争2+/+动物数量分别为8只和8只；平均值±标准差。数据采用Mann-Whitney双尾t检验进行分析。∗∗p<0.01。（G） 12个月龄雌性小鼠BAT中的相对UCP1蛋白水平。战争2V117L/V117L和战争2+/+动物数量分别为3只和3只；平均值±标准偏差。数据采用非配对t检验进行分析。∗∗p<0.01。（H） 在4个月大的雌性小鼠中测量的能量消耗（EE）通过多元线性回归（协方差分析[ANCOVA]）归一化为瘦质量。战争2V117L/V117L和战争2+/+动物数量分别为5只和5只；采用非配对双尾t检验分析平均值±SD。∗∗p＜0.01，***p<0.001。战争2V117L/V117L老鼠是蓝色方块战争2+/+老鼠是黑色的三角形。
图6
图6
线粒体生物发生的上调预防线粒体呼吸链功能障碍战争2V117L/V117L在培养的小鼠胚胎成纤维细胞中测量MEF、骨骼肌和iWAT（A和B）耗氧率（OCR）（A）和细胞外酸化率（ECAR）（B）战争2V117L/V117L和战争2+/+胚胎使用海马XF24分析仪。在基线和寡霉素（Oligo）、羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）、鱼藤酮和抗霉素（Rot/Anti）治疗后进行OCR和ECAR测量。OCR和ECAR测量值归一化为活细胞数。（C） 年基础呼吸、质子泄漏、ATP生成、最大呼吸和剩余呼吸量的相对耗氧量战争2+/+和战争2V117L/V117LMEF文化。每个基因型有9个重复；平均值±标准差。使用非配对双尾t检验或Mann-Whitney t检验对数据进行对数转换和分析。（D） MEF用MitoTracker绿色染色，每个样本30000个细胞的荧光通过荧光激活细胞分选（FACS）定量。每个基因型有3个重复；平均荧光±SD。数据采用非配对t检验进行分析。（E） 相对mRNA表达分析Pgc1α在里面战争2+/+和战争2V117L/V117LMEF文化。每个基因型有3个重复；平均荧光±标准偏差。数据采用非配对t检验进行分析。（F–H）（F）的相对mRNA表达分析Pgc1α，（G）Tfam公司、和（H）Pparα在从战争2V117L/V117L和战争2+/+12个月大的雄性小鼠。战争2V117L/V117L和战争2+/+动物数量分别为5只和5只；平均值±标准差。数据显示为对数转换，并使用非配对双尾t检验或Mann-Whitney t检验（骨骼肌和iWATPgc1α).∗p<0.05，∗∗p＜0.01，***p＜0.001，∗∗∗∗p<0.0001。战争2V117L/V117L老鼠是蓝色方块战争2+/+老鼠是黑色三角形。
图7
图7
综合应激反应的心脏特异性激活导致12个月龄雄性小鼠血浆FGF21和系统代谢变化增加（A）血浆相对FGF21蛋白水平。战争2V117L/V117L和战争2+/+动物数量分别为5只和9只；平均值±标准差。未配对t检验。（B和C）（B）的相对mRNA表达水平第21层和（C）附件4在12个月龄雄性小鼠的组织中。战争2V117L/V117L和战争2+/+动物数量分别为5只和5只；平均值±标准偏差。数据通过t检验或Mann-Whitney检验进行对数转换和分析(第21层在心里和附件4骨骼肌和iWAT）。第21层RNA在肾脏和野生型骨骼肌中的表达非常低：平均CT型> 33. （D和E）12个月龄雌性小鼠心脏、肝脏、肾脏和骨骼肌中p-eIF2α和总eIF2α蛋白水平的免疫印迹分析（D）和定量（E）。战争2V117L/V117L和战争2+/+动物数量分别为3只和3只；将条带归一化为微管蛋白，并相对于野生型表达为平均值±标准偏差。通过Welch校正的非配对t检验确定显著性。（F和G）（F）的相对mRNA表达水平附件5和（G）印章男性战争2V117L/V117L和战争2+/+12个月龄时采集的组织。战争2V117L/V117L和战争2+/+动物数量分别为8只和8只；平均值±标准偏差。数据通过t检验或Mann-Whitney检验进行对数转换和分析(附件5和印章肾脏和骨骼肌）。∗p<0.05，∗∗p＜0.01，***p<0.001。战争2v117升/v117升老鼠是蓝色方块战争2+/+老鼠是黑色三角形。另请参见图S6和S7。
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