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.2019年3月；33(3):4448-4457.
doi:10.1096/fj.201801991R。 Epub 2018年12月19日。

无乳链球菌补体干扰蛋白通过与C4和C3配体相互作用，结合了多种补体抑制机制

斯蒂芬妮娅·朱萨尼 1 2, Giampiero Pietrocola公司 2, 达尼洛·唐纳鲁玛 1, 纳撒利·诺莱 1, 彼得罗·斯佩齐亚莱 2, 莫妮卡·法布里尼 1, Immacada Margarit公司 1
附属公司

无乳链球菌补体干扰蛋白通过与C4和C3配体相互作用结合多种补体抑制机制

斯蒂芬妮娅·朱萨尼等。 美国财务会计准则委员会J. 2019年3月.

摘要

B组链球菌（GBS）定植于人类下肠道和生殖道，对孕妇的新生儿和具有潜在发病率的成人构成主要威胁。病原体表达细胞表面的毒力因子，使细胞粘附和渗透，并抵消先天性和适应性免疫反应。其中，补体干扰蛋白（CIP）最近被描述为具有与人类C4b配体相互作用以及干扰经典补体和凝集素补体途径的能力。在本研究中，我们提供证据表明CIP也可以与C3、C3b和C3d相互作用。基于免疫分析的竞争实验表明，CIP与C3d的结合干扰了C3d与B细胞上补体受体2/分化簇21（CR2/CD21）受体之间的相互作用。通过B细胞胞内信号检测，证实CIP下调CR2/CD21依赖的B细胞活化。通过氢氘交换质谱法绘制了参与C3d结合的CIP结构域。获得的数据揭示了这种GBS多肽在先天性免疫反应和适应性免疫反应之间的界面上的新作用，为包含多种免疫调节功能的革兰阳性病原体分泌的毒力因子增加了一个新成员-Giussani，S.、Pietrocola，G.、Donnarumma，D.、Norais，N.、Speziale，P.、Fabbrini，M.、Margarit，I.无乳链球菌补体干扰蛋白通过与C4和C3配体相互作用结合多种补体抑制机制。

关键词：B细胞；GBS；新生儿感染；毒力因子。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者感谢Marzia Monica Giuliani的科学讨论，Chiara Sammicheli和Simona Tavarini对流式细胞术的支持，Barbara Brogioni对SPR的支持，以及Francesca Angiolini对B细胞实验的支持（均来自意大利锡耶纳葛兰素史克公司）。本研究由葛兰素史克生物制品公司（比利时里克森萨特）赞助。D.D.、N.N.、M.F.和I.M.是葛兰素史克疫苗公司的员工。I.M.报告了GSK股份和/或限制性GSK股份的所有权，并被列为GSK公司集团所拥有专利的发明者。

数字

图1
图1
Far-Western blot分析揭示了CIP与C3、C3b、C3d之间的相互作用。A类)本研究中使用的亲和纯化His标记CIP的SDS-PAGE分析。B类)CIP经过SDS-PAGE，电印于硝化纤维素膜上，并与正常（第1道）或C3-缺失（第2道）人血清孵育；用抗C3血清和HRP结合二级抗体对膜进行检测。C类)将C3、C3b和C3d（分别为1–3道）加载到SDS-PAGE上，用CIP覆盖电印迹膜，然后是一级抗CIP血清，然后是HRP结合的二级抗体，以显示CIP结合。C3α、C3bα′和C3β的预期MW显示在右侧。
图2
图2
CIP与表面涂层C3、C3b和C3d的剂量依赖性结合。用100 ng补体因子包被微量滴度孔，并用不断增加的CIP浓度进行培养；用抗CIP多克隆血清检测结合蛋白，然后用HRP结合二级抗体检测结合蛋白。
图3
图3
CIP与C3b和C4b相互作用的竞争抑制评估。A类)将100 ng C3b的实验结果包被在96孔板上，并用0.6µM与等摩尔量的C3b或C4b预孵育的CIP覆盖，然后用抗CIP IgG pAb和抗小鼠HRP缀合的抗体孵育。B类)一个类似的实验，其中固定100 ng C4b，并覆盖0.6µM的CIP，用等摩尔量的C4b或C3b预培养。
图4
图4
通过尺寸排阻色谱和SPR分析CIP和C3d之间的相互作用。A类)将CIP和C3d分别加载或以等摩尔浓度混合到Superdex柱上；洗脱峰的分子量由校准曲线确定。B类)将CIP的两倍线性稀释系列（0.0390-5μM）注入CM5传感器芯片的C3d表面（250个响应单位）。获得的传感器图被归一化与。当重组GBS蛋白流过未涂层芯片时获得的反应。使用随系统提供的BIA 3.0软件评估每个传感器图。所示为3个实验中的1个代表，其中注射的开始和结束用箭头表示。
图5
图5
通过ELISA评估CIP与C3d的离子强度依赖性相互作用。微滴度孔涂有250 ng C3d。用CIP或CD21在含有不断增加的NaCl（0–2.5 M）浓度的缓冲液中稀释，对微孔进行探测。通过抗CIP或抗CD21 IgG pAb，以及随后的HRP结合二级抗体，可以发现复合物的形成。
图6
图6
CIP与C3d相互作用的HDx-MS分析。A类)CIP蛋白的肽覆盖率：蓝线表示在HDx实验中通过胃蛋白酶处理回收的肽。B类)在没有C3d（红色曲线）或存在C3d（蓝色曲线）的情况下，肽96-127和52-68的氘摄取超过20分钟。
图7
图7
ELISA竞争实验表明CIP抑制C3d–CR2/CD21复合物的形成。微滴度孔涂有100 ng CR2/CD21。用预先孵育的C3d（有或没有增加CIP浓度或最高浓度的Fib3蛋白）探测微孔，然后用抗C3 pAb和HRP结合的二级抗体检测结合。数据表示为在没有竞争对手的情况下检测到的吸光度值的百分比。
图8
图8
流式细胞术分析在有或无CIP的情况下C3d与B细胞的相互作用。A类)生物素化C3d与SA预培养，然后与1–9μM CIP、9μM Fib3或单独缓冲液预培养。将每种混合物加入Raji B细胞中，并按所述进行处理。使用C3d特异性单克隆抗体和藻红蛋白标记的二级抗体通过流式细胞术显示生物素化C3d–SA复合物与细胞的结合。用FlowJo软件分析了峰的平均荧光强度值。该图显示了在存在竞争对手的情况下，与单独的缓冲液相比，残余平均荧光强度值的百分比，这是从4个独立实验得出的。B类)在存在或不存在1.5或9μM CIP或9μM Fib3的情况下，流式细胞术分析C3d与人PBMC富集B细胞的结合；实验条件与A类.
图9
图9
流式细胞术分析有无CIP时B细胞内钙动员。A类)触发细胞内钙增加的刺激的图示（蓝色方框）；在每次实验之前，使用生物素化抗人IgM抗体（红盒）测量替代刺激基线。刺激物旨在将B细胞受体（BCR）交联至CR2/CD21。B类,C类)Raji细胞与Fura Red预孵育，然后进行刺激（参见A类). 0.5–20μM CIP(B类)或20μM的Fib3(C类)与C3d–生物素–SA预孵育以评估其抑制效果；在540s内监测细胞荧光变化，并用流式细胞仪进行分析。显示了所执行的3个实验中的一个代表。
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引用人

  • 补体C4、感染和自身免疫疾病。
    王浩、刘明。 王浩等。 前免疫。2021年7月14日；12:694928. doi:10.3389/fimmu.2021.694928。eCollection 2021年。 前免疫。2021 PMID：34335607 免费PMC文章。 审查。

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