The ASCIZ-DYNLL1 axis promotes 53BP1-dependent non-homologous end joining and PARP inhibitor sensitivity

doi:10.1038/s41467-018-07855-x

.2018年12月17日；9(1):5406.

doi:10.1038/s41467-018-07855-x。

ASCIZ-DYNLL1轴促进53BP1依赖的非同源末端连接和PARP抑制剂敏感性

附属公司

¹基因组完整性实验室，英国牛津大学威康人类遗传学中心，牛津，OX3 7BN。
²荷兰肿瘤研究所Oncode研究所分子病理科，荷兰阿姆斯特丹，1066 CX。
^三圣文森特医学研究所，菲茨罗伊，维多利亚州，3065，澳大利亚。
⁴英国BN1 9RQ法尔默苏塞克斯大学生命科学学院基因组损伤与稳定中心。
⁵英国牛津大学OX1 3TH药理学系MRC脑网络动力学单元。
⁶牛津大学威瑟尔分子医学研究所肿瘤学系，约翰·拉德克利夫医院，牛津，OX3 9DS，英国。
⁷CRUK/MRC牛津大学放射肿瘤学研究所，牛津大学，OX3 7DQ，英国。
⁸澳大利亚维多利亚州菲茨罗伊墨尔本大学墨尔本医学院圣文森特医院医学部，邮编：3065。
⁹瑞士伯尔尼大学兽医学院动物病理学研究所，邮编：3012。
¹⁰基因组完整性实验室，英国牛津大学威康人类遗传学中心，牛津，OX3 7BN。rchapman@well.ox.ac.uk。

采购管理信息： 30559443
预防性维修识别码：项目经理6297349
内政部： 10.1038/s41467-018-07855-x号

ASCIZ-DYNLL1轴促进53BP1依赖的非同源末端连接和PARP抑制剂敏感性

乔丹·R·贝克尔等。国家公社. 2018.

.2018年12月17日；9(1):5406.

doi:10.1038/s41467-018-07855-x。

附属公司

¹基因组完整性实验室，英国牛津大学威康人类遗传学中心，牛津，OX3 7BN。
²荷兰肿瘤研究所Oncode研究所分子病理科，荷兰阿姆斯特丹，1066 CX。
^三圣文森特医学研究所，菲茨罗伊，维多利亚州，3065，澳大利亚。
⁴英国BN1 9RQ法尔默苏塞克斯大学生命科学学院基因组损伤与稳定中心。
⁵英国牛津大学OX1 3TH药理学系MRC脑网络动力学单元。
⁶牛津大学威瑟尔分子医学研究所肿瘤学系，约翰·拉德克利夫医院，牛津，OX3 9DS，英国。
⁷CRUK/MRC牛津大学放射肿瘤学研究所，牛津大学，OX3 7DQ，英国。
⁸澳大利亚维多利亚州菲茨罗伊墨尔本大学墨尔本医学院圣文森特医院医学部，邮编：3065。
⁹瑞士伯尔尼大学兽医学院动物病理学研究所，邮编：3012。
¹⁰基因组完整性实验室，英国牛津大学威康人类遗传学中心，牛津，OX3 7BN。rchapman@well.ox.ac.uk。

采购管理信息： 30559443
预防性维修识别码：项目经理6297349
内政部： 10.1038/s41467-018-07855-x号

摘要

53BP1控制一种特殊的非同源末端连接（NHEJ）通路，该通路对适应性免疫至关重要，但在BRCA1突变癌症中是致癌的。免疫球蛋白类转换重组（CSR）过程中的染色体内DNA双链断裂（DSB）连接事件需要53BP1。然而，在BRCA1突变细胞中，53BP1阻断同源重组（HR）并促进毒性NHEJ，导致基因组不稳定。在这里，我们确定蛋白质二聚化hub-DYNLL1是多聚体53BP1复合物的组织者。DYNLL1结合刺激53BP1低聚，并促进53BP1募集到DSB相关染色质，并与之相互作用。因此，DYNLL1调节53BP1依赖的NHEJ：当DYNLL1或其转录调节物Asciz缺失，或53BP1中DYNLL2结合基序突变时，CSR受损；此外，当Dynll1或Asciz缺失时，Brca1突变细胞和肿瘤对多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂治疗产生耐药性。因此，我们的结果揭示了一种调节53BP1依赖性NHEJ和BRCA1缺陷癌症治疗反应的机制。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
DYNLL1向DSB站点推广OD依赖型53BP1招募。一 *53桶/小时*^-/-照射稳定表达所示53BP1转基因的MCF-7细胞（5 Gy），固定4 h后，用抗HA（53BP1）和抗γH2AX抗体进行免疫染色。数据，代表n个 = 三独立实验。ODΔ表示氨基酸1230–1270缺失，ODm表示氨基酸1258–1261突变为丙氨酸。b条在稳定细胞系中测定了所示53BP1结构的IRIF形成能力，如(一) 4 5小时后 Gy辐照最小值为n个 = 2独立实验。**c（c）**如中所示(一-b条)，但具有指示的WT和突变53BP1结构。数据，代表n个 = 2个独立实验。53BP1中的1142-1181个氨基酸被描述为LC8m等位基因中突变为丙氨酸的6个氨基酸。d日自动化53BP1 IRIF数据量化(**c（c）**). 每个点代表一个具有n个 ≥ 每种情况下65个细胞核得分。显示中间值。数据，代表n个 = 2个独立实验。**e（电子）**左，53BP1 IRIF 4的量化辐照后h（5 Gy）。通过Mann-Whitney U检验确定显著性。对，实验细胞系的免疫印迹分析。每个点代表一个具有n个 ≥ 每种情况下131个细胞核得分。显示了中位数。数据，代表n个 = 2个独立实验。**（f）**FLAG-HA-53BP1免疫复合物是从未经处理和辐照（10 Gy，1个 h） 293港元 T培养，48 用指示对照（GST）或53BP1表达质粒转染后h。代表性数据，n个 = 2个独立实验

图2
53BP1相关类开关重组需要DYNLL1。一体外CSR至IgG1Dynll公司1^前/后 *Cd23-Cre公司*^{Tg（千克）}和控制*Cd23-Cre公司*^{Tg（千克）}成熟B脾细胞，96 LPS和IL-4刺激后h。典型的流式细胞仪图显示了与CellTrace紫罗兰（CTV）共同染色的细胞中IgG1阳性细胞比例。b条IgG1-阳性（IgG1⁺)通过CTV染色和增殖相关染料稀释确定每代细胞中B细胞占总B细胞的比例（%）。显著性通过未配对双尾学生的t检验确定，并对多重比较进行Holm-Sidak校正。数据，n个 = 平均5只小鼠 ± 扫描电镜。**c（c）**体外CSR对成熟B脾细胞IgG1的影响*P53结合蛋白1*^-/-小鼠，96 LPS和IL-4刺激后h，72 逆转录病毒互补后h。代表性地块。d日（C）的量化。条形代表平均值，n个 = 4只小鼠。非配对双尾学生t检验的统计分析

图3
稳定的53BP1染色质相互作用需要DYNLL1依赖和独立的齐聚模式。一具有代表性的FRAP系列。示例显示WT mC2-f53BP1的回收。右下角显示漂白区域的放大区域。所有FRAP实验均在*53制动踏板1*^-/-稳定表达所示mC2-f53BP1片段的MCF-7细胞。b条表达mC2-f53BP1的细胞中单个FRAP实验的平均回收率(n个 = 8），mC2-f53BP1^LC8米(n个 = 9），或mC2-f53BP1^ODm公司(n个 = 10），平均值 ± SEM.数据，代表n个 = 3个独立实验。**c（c）**表达mClover2-WT的单个细胞中IRIF最大最终荧光的半恢复时间(n个 = 26），mC2-f53BP1^LC8米(n个 = 26）或mC2-f53BP1^ODm公司(n个 = 25）蛋白质。平均值 ± CI（95%）。*P（P）-*值，Mann–Whitney U检验。d日三个聚合实验的最佳拟合曲线。数据点表示n个 ≤ 25次测定。**e（电子）**生成曲线的计算初始速率（dy/dt）(d日).（f）净化Smt3-His₆-标记的DYNL1与Smt3-His孵育₆-标记为53BP1^ODm公司或53BP1^LC8m/ODm如图所示的碎片（公元1131年至1292年）。1 μg的53BP1随着DYNLL1浓度的增加而加入到每个反应中。DYNLL1:53BP1的摩尔比率从左到右；1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1. 样品通过天然（8%）或变性（12%）PAGE进行分级，并用考马斯亮蓝染色。数据，代表n个 = 2个独立实验

图4
ASCIZ和DYNL1共同调节53BP1依赖的奥拉帕林敏感性*布尔卡1-*缺陷细胞。一测定奥拉帕林电阻的实验示意图。b条在DMSO或olaparib中生长后，KB1P-G3细胞中指示靶基因的编辑等位基因百分比的变化（75 nM）。数据，代表n个 = 3个独立实验。**c（c）**在DMSO或olaparib中第二轮olaparibgrowth（II）的代表性图像。d日奥拉帕林生长定量（300 nM）用指示的指导RNA转导后。量化n个 = 3个独立实验，每个实验有三个技术副本。平均值 ± SD：通过非配对双尾t检验确定显著性。**e（电子）**中编辑的等位基因百分比的变化*P53结合蛋白1*^-/- *第53页*^-/-在DMSO或olaparib中生长后的KB1P-G3细胞（75 nM）。数据，代表n个 = 2个独立实验。**（f）**奥拉帕林治疗后移植器官的相对肿瘤体积。n个 > 每种情况7只动物。克卡普兰-迈耶图显示了器官移植动物的存活率。通过Log-rank-Mantel-Cox检验确定sgNT-olaparib和sgASCIZ-olaparab之间的显著性(第页 = 0.0018).n个 > 每种情况7只动物

图5
DYNLL1是53BP1依赖性p53对Nutlin-3的应答所必需的。一MCF-7细胞系的免疫印迹分析(一)N3治疗前使用抗53BP1或抗RPA32抗体。b条量化n个 = 3个独立实验，以(一)，每份一式三份。平均值 ± 标准偏差。**c（c）**显示为母公司或稳定补充*53制动踏板1*^-/-MCF-7细胞系在有无Nutlin-3（4 微米）

图6
DYNLL1和OD介导了53BP1齐聚的二价模式。53BP1的定位和功能取决于二价OD-和DYNLL1介导的低聚模式（上，左）。单单OD介导的寡聚化就足以进行染色质结合，但会导致严重的DSB修复缺陷（右上图）。DYNLL1介导的寡聚化也足以支持53BP1的募集以破坏位点，但不支持DNA修复（底部，左）。OD和DYNLL1介导的寡聚化模式的缺失消除了53BP1对DNA损伤位点的补充以及所有相关的修复功能（底部，右侧）

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中的注释

通过DYNLL1介导的53BP1再分配，NHEJ的新兴监管网络。
Zalmas LP、Lu WT、Kanu N。 Zalmas LP等人。 Ann Transl Med.2019年7月；7（补充3）：S93。doi:10.21037/atm.2019.04.39。《Ann Transl Med.2019》。采购管理信息：31576301 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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[5] Ciccia A，Elledge SJ。DNA损伤反应：让刀子玩起来更安全。分子细胞。2010年；40:179–204. doi:10.1016/j.molcel.2010.09.019。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[7] Hustedt N，Durocher D.细胞周期对DNA修复的控制。自然细胞生物学。2016;19:1. doi:10.1038/ncb3452。-内政部-公共医学

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[10] 查普曼JR、泰勒MR、博尔顿SJ。玩终局游戏：DNA双链断裂修复路径选择。分子细胞。2012年；47:497–510. doi:10.1016/j.molcel.2012.07.029。-内政部-公共医学

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