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.2019年2月4日;218(2):615-631.
doi:10.1083/jcb.201806153。 Epub 2018年12月17日。

逆转录酶通过内体运输载体在货物分拣中具有选择性功能

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逆转录酶通过内体运输载体在货物分拣中具有选择性功能

易翠等。 J细胞生物学. .

摘要

逆转录酶是一种外周膜蛋白复合物,在溶酶体系统中协调多种囊泡转运事件。在这里,我们证明逆转录酶是维持正常溶酶体形态和功能所必需的。逆转录酶亚单位Vps35的敲除导致溶酶体结构的超微结构改变和溶酶体功能异常,导致自噬受损。在全细胞水平上,由于溶酶体水解酶的处理不当,逆转录酶Vps35亚基的敲除降低了溶酶体的蛋白水解能力,而溶酶体水解能力依赖于阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体(CI-M6PR)的运输。通过逆转录酶依赖性过程将CI-M6PR掺入内体转运载体仅限于那些被GCC88束缚的载体,而不是golgin-97或golgin-245。最后,我们表明,这种逆转录酶依赖的逆行货物运输途径需要SNX3,但不需要其他逆转录酶相关货物结合蛋白,如SNX27或SNX-BAR蛋白。因此,逆转录酶确实有助于溶酶体水解酶成熟和溶酶体功能所需的CI-M6PR的逆行运输。

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图1。
图1。
Vps35 KO细胞溶酶体结构的超微结构改变和自噬增加。(A)CRISPR/Cas9介导的Vps35 KO-HeLa细胞和Vps35-GFP救援细胞的生成。对来自HeLa、Vps35 KO和Vps35-GFP救援细胞的等量细胞裂解物进行SDS-PAGE,并用Vps35、Vps26A、Vps29和微管蛋白抗体进行免疫印迹。(B)HeLa、Vps35 KO和Vps35 GFP拯救细胞的电子显微照片。扩大的圆形结构表示为晚期内体/溶酶体结构。比例尺,2000 nm;在缩放图像中,500 nm。图表表示HeLa、Vps35 KO和Vps35-GFP拯救细胞中溶酶体隔室相对于细胞质的体积密度百分比(平均值±SEM)。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性,P<0.01;***,P<0.001。n个=两个独立实验,每个实验有10张图像。(C)基于LysoTracker荧光的HeLa和Vps35 KO细胞中细胞酸化的流式细胞术分析。图表表示HeLa和Vps35 KO细胞内的平均荧光强度(平均值±SEM)。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3).(D)HeLa、Vps35 KO和Vps35-GFP拯救细胞被固定,并与抗LC3-II和LAMP1的抗体共同免疫标记,然后是Alexa Fluor共轭荧光二级抗体。比例尺,5µm。通过Pearson相关系数(平均值±SEM)量化LC3-II和LAMP1之间的共定位。双尾学生的t吨试验用于确定氨基酸刺激后HeLa、Vps35-KO和Vps35-GFP救援细胞之间的统计显著性(n个= 3). ***, P<0.001;****,P<0.0001。(E)用氯喹(CQ,50µM)处理HeLa和Vps35 KO细胞6 h。收集细胞,并使用等量的蛋白质样品进行SDS-PAGE和免疫印迹,以及LC3-II、Vps35和GAPDH抗体。图表表示根据GAPDH标准化的LC3-II水平(平均值±SEM)。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3). *, P<0.05;**,P<0.01。(F)用2×必需氨基酸溶液处理氨基酸缺乏的HeLa、Vps35 KO和Vps35-GFP拯救细胞30 min,用冰镇甲醇固定,并与抗mTORC1和LAMP1抗体共免疫,然后用Alexa Fluoro共轭荧光二级抗体(平均值±SEM)共免疫。比例尺,5µm。通过Pearson相关系数量化mTORC1与LAMP1的共定位。双尾学生的t吨测试表明HeLa和Vps35 KO细胞在氨基酸刺激下的差异(n个=3).***,P<0.001;****,P<0.0001。(G)用AZD8055(1µM)处理HeLa和Vps35 KO细胞25 h,然后进行SDS-PAGE,并用LC3-II、Vps35和GAPDH抗体进行免疫印迹。图表表示根据GAPDH标准化的LC3-II表达水平(平均值±SEM)。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3). *, P<0.05。
图2。
图2。
逆转录酶缺乏导致溶酶体活性降低。(A)用AF647-共轭BSA(200µg/ml)在37°C的完全培养基中处理HeLa和Vps35 KO细胞1 h。然后固定细胞并进行荧光显微镜检查。图表表示HeLa和Vps35 KO细胞内吞入BSA结合物的荧光强度(平均值±SEM)。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3).(B)HeLa、Vps35 KO和Vps35-GFP救援细胞在37°C的完全培养基中用DQ-BSA红(10µg/ml)处理过夜。细胞被固定并用抗LAMP1抗体进行免疫标记,然后是Alexa Fluor-共轭荧光二级抗体。比例尺,10µm。图表表示HeLa、Vps35 KO和Vps35-GFP救援细胞中DQ-BSA红的荧光强度(平均值±SEM)。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个=3).*,P<0.05;***,P<0.001。(C)制备HeLa和Vps35 KO细胞的溶酶体亚组分,并用免疫印迹法测定溶酶体酶β-己糖胺酶、酸性磷酸酶2、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖脑苷酶的蛋白水平。将印迹相关区域的Ponceau S染色作为负荷对照。图表表示HeLa和Vps35 KO细胞溶酶体富集部分中β-半乳糖苷酶的水平(平均值±SEM)。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3). *, P<0.05。(D)使用4-MU检测系统通过荧光分析法分析富含溶酶体组分的溶酶体酶活性,并以nmol●min为单位进行计算−1●毫克−1输入蛋白质。图表表示HeLa和Vps35 KO细胞之间酶活性的倍数差异(平均值±SEM)。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3). *, P<0.05。(E)HeLa、Vps35 KO和Vps35-GFP救援细胞在37°C的完全培养基中用魔红组织蛋白酶-B处理,并用倒置尼康Ti-E显微镜和哈马松Flash 4.0 sCMOS相机进行延时视频显微镜成像。图表表示指定时间HeLa、Vps35 KO和Vps35-GFP救援细胞内的魔红组织蛋白酶B荧光强度(平均值±SEM)。n个=两个独立实验,每个实验有八个随机点。*,P<0.05;**,P<0.01;****,P<0.0001。
图3。
图3。
有效的CI-M6PR贩运和组织蛋白酶-D处理需要Vps35。(A)用100µg/ml环己酰亚胺在含有2 mM谷氨酰胺的无血清培养基中对HeLa和Vps35 KO细胞进行0、3、6和9小时的脉冲处理。从含有等量细胞的细胞单层中收集培养基样品,并用组织蛋白酶D抗体进行免疫印迹。(B)使用内源性CI-M6PR、p230、EEA1、TfR和LAMP1抗体通过间接免疫荧光法测定CI-M6RR在HeLa和Vps35 KO细胞中的分布。比例尺,10µm。CI-M6PR和不同细胞器标记之间的共定位通过Pearson相关系数进行量化,并用图表表示(平均值±SEM)。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3). *, P<0.05;**,P<0.01。(C)使用抗CD8α抗体对瞬时转染CD8α-CI-M6PR结构的HeLa和Vps35 KO细胞进行内化分析。在37°C下摄取60分钟后,CD8α-CI-M6PR复合物向TGN和早期内体的递送通过间接免疫荧光法测定,使用抗golgin-97和Rab5抗体,然后使用Alexa Fluor共轭荧光二级抗体。比例尺,10µm。CD8α-CI-M6PR与指示分子标记之间的共定位通过Pearson相关系数进行量化,并用图表表示(平均值±SEM)。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3). ****, P<0.0001。
图4。
图4。
Vps35 KO细胞中不存在由GCC88连接的含有CI-M6PR的ETC。(A)HeLa和Vps35 KO细胞瞬时转染单个HA标记的线粒体靶向golgin构建物:GCC88-MAO、golgin-97-MAO、Golkin-245-MAO和GM130-MAO。细胞被固定,并与HA和内源性CI-M6PR抗体共同免疫标记,然后是Alexa Fluor共轭荧光二级抗体。比例尺,10µm。荧光强度(y轴)与距离(x轴)的强度图表示通道之间的重叠。(B)通过Pearson相关系数(平均值±SEM)量化CI-M6PR和HA标记的高尔基-米蛋白之间的共定位。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3). ****, P<0.0001。(C)用HA标记的线粒体靶向golgin构建物GCC88-MAO、golgin-97-MAO、Golkin-245-MAO和GM130-MAO瞬时转染HeLa和Vps35 KO细胞;固定的;与HA和内源性CD-M6PR抗体共免疫标记,然后与Alexa Fluor-共轭荧光二级抗体共免疫。比例尺,10µm。荧光强度(y轴)与距离(x轴)的强度图表示通道之间的重叠。通过Pearson相关系数(平均值±SEM)量化CD-M6PR和HA标记的golgin-mito蛋白之间的共定位。双尾学生的t吨用于确定统计显著性(n个= 3).(D)用HA标记的GCC88-MAO或GM130-MAO构建物瞬时转染Vps35 KO、Vps35-GFP拯救和未标记的野生型Vps35拯救细胞,固定并与HA和内源性CI-M6PR抗体共免疫标记,然后是Alexa Fluor共轭荧光二级抗体。采用Pearson相关系数(平均值±SEM)定量CI-M6PR与HA标记的高尔基-巨噬细胞蛋白GCC88和GM130之间的共定位。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3). ****, P<0.0001。
图5。
图5。
CI-M6PR GCC88以太网ETC的逆行传输需要SNX3。(A)对来自HeLa、SNX1/2 dKO、SNX3 KO和SNX27 KO细胞的等量细胞裂解物进行SDS-PAGE,并用Vps35、Vps26A、SNX1、SNX2、SNX5、SNX6、SNX27、SNX3和微管蛋白抗体进行免疫印迹。(B和C)用HA标记的线粒体靶向golgin构建物GCC88-MAO、golgin-97-MAO、Golkin-245-MAO或GM130-MAO瞬时转染HeLa、SNX3 KO、SNX1/2 dKO和SNX27细胞;固定的;与抗HA和内源性CI-M6PR(B)或CD-M6PR(C)抗体共免疫标记,然后与Alexa Fluor结合的二级抗体共免疫。荧光强度(y轴)与距离(x轴)的强度图表示通道之间的重叠。CI-M6PR(B)或CD-M6PR(C)与HA标记的高尔金有丝分裂蛋白的共定位通过Pearson相关系数(平均值±SEM)进行定量。双尾学生的t吨测试用于确定统计显著性(n个= 3). **, P<0.01;****,P<0.0001。
图6。
图6。
哺乳动物细胞中负责CI-M6PR内体到TGN转运的两种独立类型ETC的证据。在哺乳动物细胞中,CI-M6PR可分为依赖于逆转录酶/SNX3的ETC,并由GCC88在TGN上连接。或者,CI-M6PR可以被分类为不依赖于逆转录酶,但依赖于SNX-BAR蛋白的ETC,并在TGN处被golgin-245束缚。最近确定的桥接蛋白TBC1D23(Shin等人,2017)不需要用于连接GCC88依赖型ETC,但需要用于连接golgin-245的ETC。

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引用人

工具书类

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