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.2018年10月6日;8(19):5200-5212.
doi:10.7150/thno.27806。 2018年eCollection。

OGT下调通过诱导卵巢癌自噬促进顺铂耐药

附属公司

OGT下调通过诱导卵巢癌自噬促进顺铂耐药

周福兴等。 治疗诊断科技. .

摘要

顺铂耐药严重影响卵巢癌患者的生存率。然而,卵巢癌顺铂耐药的主要机制尚不清楚。方法:免疫组织化学检测OGT、OGA和O(运行)-化疗耐药和化疗敏感性卵巢癌组织中的GlcNAc。进行功能分析(体外和体内)以确认OGT在顺铂耐药中的作用。western blot检测自噬相关蛋白。透射电镜和mRFP-GFP-LC3腺病毒报告子用于自噬通量分析。免疫沉淀法用于检测蛋白质相互作用。结果:我们发现了O(运行)-GlcNAc和O(运行)-化疗耐药卵巢癌组织中的GlcNAc转移酶(OGT)水平显著低于化疗敏感组织,而O(运行)-GlcNAcase(OGA)水平没有差异。OGT的下调增加了卵巢癌细胞对顺铂的耐药性,但对紫杉醇的疗效没有影响。OGT的下调提高了小鼠异种移植瘤模型对顺铂的耐药性。OGT敲除增强了顺铂诱导的自噬,从而减少了顺铂引起的凋亡细胞死亡,并促进了自溶体的形成。减少O(运行)-OGT下调引起的GlcNAcylated SNAP-29水平促进了SNARE复合物的形成和自噬通量。结论:我们的研究结果表明,OGT的下调增强了顺铂通过SNAP-29诱导的自噬,从而导致顺铂耐药的卵巢癌。OGT可能是克服卵巢癌顺铂耐药性的新靶点。

关键词:OGT;陷阱。;自噬;耐药;卵巢癌。

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数字

图1
图1
OGT和O(运行)-耐药卵巢癌组织中的GlcNAc减少。OGT免疫组织化学染色,O(运行)-对化疗耐药和化疗敏感性卵巢癌组织切片进行GlcNAc和OGA检测。(A)染色组织以200倍和400倍的放大倍数显示。比例尺代表50μm。(B)两组的H-SCORE。**P(P)< 0.01,*P(P)< 0.05.
图2
图2
OGT下调增强卵巢癌细胞株对顺铂的耐药性。(A)A2780和SKOV3转染对照或OGT公司shRNA建立稳定的OGT缺陷细胞系。用蛋白质印迹法检测OGT在对照细胞和OGT缺陷细胞中的表达。(B-C)用不同浓度的顺铂处理对照细胞和OGT缺陷细胞48 h。用CCK-8测定顺铂处理后A2780(B)和SKOV3(C)细胞的存活率。(D)用顺铂(5µg/mL)处理对照细胞和OGT缺陷细胞24小时。通过ANXA5和PI染色测量凋亡细胞。显示的数字是ANXA5阳性细胞和双阳性细胞的总和。(电子版)用不同浓度的紫杉醇处理对照细胞和OGT缺陷细胞48 h。紫杉醇治疗后用CCK-8测定A2780(E)和SKOV3(F)的细胞活力。(G)用紫杉醇(100 nM)处理对照细胞和OGT缺陷细胞24 h。通过ANXA5和PI染色测量凋亡细胞。显示的数字是ANXA5阳性细胞和双阳性细胞的总和。数值表示为平均值±SD(n=3)。**P(P)< 0.01,*P(P)< 0.05.
图3
图3
OGT缺乏导致体内顺铂耐药。(A)将SKOV3对照细胞和OGT缺陷细胞注射到BALB/c裸鼠的两侧。每隔一天测量肿瘤体积。数据显示为平均值±SEM(n=16)。(B)细胞注射后23天,小鼠每周腹腔注射PBS或顺铂(3 mg/kg)3次,共2周。每隔一天测量肿瘤体积。数据显示为平均值±SEM(n=8)。*P(P)<0.05 vs Con sh-PBS,OGT公司sh-PBS,或OGT公司sh-cis组。(C)代表性肿瘤。(D)IHC检测OGT在肿瘤中的表达。比例尺代表50μm。
图4
图4
OGT的下调增强了顺铂诱导的卵巢癌细胞自噬。(A-B)用或不用顺铂(5µg/mL)处理A2780和SKOV3细胞24小时。用western blotting检测LC3和p62的表达水平。(C-D)用顺铂(5µg/mL)处理对照组和OGT缺失的卵巢癌细胞24小时。通过western blotting测定LC3和p62的表达水平。(E)对照组和OGT缺陷卵巢癌细胞与顺铂(5µg/mL)培养24 h。通过荧光显微镜检测LC3点。比例尺代表50μm。数值表示为平均值±SD(n=3)。**P(P)< 0.01,*P(P)< 0.05.
图5
图5
OGT的下调促进顺铂诱导的自溶体的形成。(A)OGT缺陷的A2780和SKOV3细胞在不同浓度的顺铂和3-MA(3 mM)或Baf(200 nM)中培养48 h。用CCK-8测定细胞活力。(B)在顺铂(5µg/mL)存在下,用3-MA(3mM)或Baf(200nM)处理OGT缺陷的A2780和SKOV3细胞24小时。通过ANXA5和PI染色鉴定凋亡细胞。(C-D)用mRFP-GFP-LC3载体转染对照和OGT-缺陷的A2780(C)和SKOV3(D)细胞24小时,然后用顺铂(5µg/mL)处理24小时。显示了荧光LC3点的典型图像。绘制了代表自噬体的黄色点平均数和代表自溶体的红色点平均数。*P(P)与Con-sh+cis组相比,<0.05。比例尺代表10μm。(E)对照组和OGT缺失的A2780和SKOV3细胞用顺铂处理24 h,然后用透射电镜进行分析。比例尺代表500 nm。(F)用RFP-LC3质粒转染OGT缺陷的SKOV3细胞,然后用顺铂(5µg/mL)处理24 h。用抗Lamp1检测Lamp1 puncta。比例尺代表10μm。数值表示为平均值±SD(n=3)。**P(P)< 0.01,*P(P)< 0.05.
图6
图6
这个O(运行)-SNAP-29的GlcNA酰化水平与顺铂诱导的自噬活性相关。(A)用NC siRNA或SNAP-29系统siRNA,然后用顺铂(5µg/mL)处理24小时。通过western blotting检测LC3和p62的表达水平。(B)用mRFP-GFP-LC3载体转染OGT-缺陷SKOV3细胞24 h,然后用NC siRNA或SNAP-29系统小干扰RNA。在顺铂(5µg/mL)中培养24小时后,用共焦显微镜对细胞成像。显示了荧光LC3点的代表性图像。*P(P)与相比<0.05OGT公司sh组。比例尺表示10μm。(C)稳定表达对照shRNA或OGT公司用顺铂(5µg/mL)处理shRNA 24 h,然后用western blotting检测SNAP-29的表达。(D)用顺铂(5µg/mL)处理24小时后,用抗SNAP-29免疫沉淀对照组和OGT缺陷的SKOV3细胞提取物,并用免疫印迹法对所得沉淀物进行免疫印迹O(运行)-GlcNAc。对全细胞裂解物进行SNAP-29和肌动蛋白测试。(E)用SNAP-29-GFP和RFP-LC3载体转染对照组和OGT-缺陷SKOV3细胞,然后用顺铂(5µg/mL)处理24小时。通过共焦荧光显微镜测定SNAP-29和LC3的集落化。比例尺代表10μm。数值表示为平均值±SD(n=3)。**P(P)< 0.01,*P(P)< 0.05.
图7
图7
O(运行)-SNAP-29的GlcNAcylation调节SNAP-28与Stx17和VAMP8的相互作用。(A)用SNAP-29和SNAP-29Mut载体转染SKOV3细胞,然后用顺铂(5µg/mL)处理24小时O(运行)-用免疫共沉淀法检测SNAP-29的GlcNA酰化水平。(B)用SNAP-29-GFP、SNAP-29(Mut)-GFP和RFP-LC3载体转染SKOV3细胞,然后用顺铂(5µg/mL)处理24 h。通过共焦荧光显微镜测定SNAP-28和LC3的克隆化。比例尺代表10μm。(C)用对照、SNAP-29或SNAP-29Mut载体转染SKOV3细胞,然后用顺铂(5µg/mL)处理24 h。通过western blotting检测LC3和p62的表达。(D)转染siRNA的SKOV3细胞中LC3和p62的表达标准17或siVAMP8型并用顺铂(5µg/mL)处理24小时。(E)用SNAP-29或SNAP-29Mut载体转染SKOV3细胞,然后用顺铂(5µg/mL)处理24 h。然后,用抗SNAP-2九免疫沉淀细胞提取物,并对所得沉淀物进行Stx17和VAMP8免疫印迹。对全细胞裂解物进行SNAP-29和肌动蛋白测试。数值表示为平均值±SD(n=3)。**P(P)< 0.01,*P(P)< 0.05.

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