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.2019年1月;11(1):e9582。
doi:10.25252年2月2日至2018年9月82日。

APOPT1/COA8辅助COX装配,并由UPS和ROS进行相反调节

附属公司

APOPT1/COA8辅助COX装配,并由UPS和ROS进行相反调节

阿尔巴·西恩斯等。 EMBO分子医学. 2019年1月.

摘要

功能丧失突变4月1日是一种仅在高等真核生物中发现的基因,可导致一种与线粒体细胞色素相关的空泡型白质脑病c(c)氧化酶(COX)缺乏。虽然APOPT1致病性变异体与孤立COX缺陷的遗传关联现在已经很清楚,但APOPT1功能与COX之间的生化联系仍不明确。我们使用不同的方法研究了APOPT1的分子作用。首先,我们生成了一个密码1敲除小鼠模型显示运动技能受损,例如运动协调性和耐力下降,与多种组织中COX活性和水平下降有关。此外,通过在对照细胞和患者源培养细胞中实现野生型APOPT1的稳定表达,我们排除了该蛋白在凋亡中的作用,并确定该蛋白是COX正确组装和功能所必需的。另一方面,APOPT1稳态水平显示由泛素蛋白酶体系统(UPS)控制。相反,在氧化应激增加的条件下,APOPT1稳定,增加其成熟的线粒体内形式,从而保护COX免受氧化诱导的降解。

关键词:APOPT1‐COA8;细胞色素c氧化酶;线粒体脑病;蛋白酶体-泛素系统;活性氧物种。

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数字

图1
图1。生成密码1敲除小鼠模型
  1. A类

    小鼠12号染色体靶向断裂策略密码1通过CRISPR/Cas9编码外显子2。选择用于小鼠模型表征的突变产生indel(c.188delAinsTG),导致移码和截短蛋白(p.Asp55Valfs*20)。

  2. B类

    桑格测序生成的色谱图密码1 −/−(KO)和密码1 +/+(WT)基因组DNA,与野生型序列相比,突出了突变位置。

  3. C类

    相对mRNA表达密码1正常化为野生型、杂合型和3个月龄敲除小鼠骨骼肌和肝脏中GAPDH的表达。数据表示为平均值±SEM(n个=每个基因型6只小鼠)。星号表示使用Sidak的多重比较测试(肌肉)通过双向方差分析计算的显著性水平-***P(P)=0.0001(重量vs.KO)*P(P)=0.0310(重量vs.het)*P(P)=0.0395(het vs.KO),肝脏-**P(P)=0.0022(重量vs.KO)*P(P)=0.0101(重量vs.het)。

图2
图2。临床表型特征密码1基因剔除小鼠
  1. A类

    在3个月、6个月和12个月大的雌性和雄性动物中测量的体重。数据以平均值±SEM表示(n个=每组5人)。

  2. B类

    受试雌性和雄性小鼠在3个月龄和12个月龄时在跑步机上跑的距离。数据表示为平均值±SEM(n个=每组6人)。星号表示通过Sidak多重比较测试的双向方差分析计算的显著性水平:女性-****P(P)<0.0001(3个月)***P(P)=0.0004(12个月),男性-****P(P)<0.0001(3个月)**P(P)=0.0019(12个月)。

  3. C类

    不同年龄的雌性和雄性小鼠在Rotarod圆柱体上跌落之前所花费的时间(以秒为单位)。数据表示为平均值±SEM(n个=每组5人)。星号表示通过Sidak多重比较测试的双向方差分析计算的显著性水平:女性-**P(P)=0.0059(3个月)**P(P)=0.0083(6个月)*P(P)=0.0391(12个月),男性-**P(P)=0.0069(12个月)。

  4. D类

    不同年龄段Y迷宫每只手臂的进入次数。数据表示为平均值±SEM(n个=每组10人)。星号表示使用Sidak的多重比较测试通过双向方差分析计算的显著性水平:****P(P) < 0.0001.

  5. E类

    在活动笼中测量12个月大小鼠的自发水平和垂直运动总量。数据表示为平均值±SEM(n个=每组6人)。星号表示使用Sidak的多重比较测试通过双向方差分析计算的显著性水平:****P(P)<0.0001(水平)。

图3
图3。小鼠组织的形态学、生物化学和结构分析
  1. A类

    3个月大个体骨骼肌的代表性苏木精和伊红染色。

  2. B类

    同一个体骨骼肌、小脑皮质和肾脏中COX和SDH的组织化学反应。

  3. C类

    COX(CIV)酶活性与柠檬酸合成酶(CS)活性在3个月龄和12个月龄时每种基因型的五只动物中进行了标准化。数据表示为平均值±SEM(n个=每组6人)。星号表示使用Sidak的多重比较测试(三个月:肌肉(SM))通过双向方差分析计算的显著性水平-***P(P)=0.0001(WT与KO),肾脏(K)-***P(P)=0.0002(WT vs.KO),心脏(H)-***P(P)=0.0001(WT vs.KO),大脑(B)和肝脏(L)-****P(P)<0.0001(重量vs.KO)。十二个月:SM和L-****P(P)<0.0001,B-***P(P)=0.0008(重量vs.KO)。

  4. D类

    对所示基因型的肝脏、骨骼肌和大脑的总裂解物进行SDS-PAGE的Western blot分析,每个通道显示一只动物的结果。该图显示了在肝脏中获得的信号的密度定量。数据表示为平均值±SEM(n个=2重量;n个=2 het;n个=3 KO)。星号表示通过双向方差分析和Sidak的多重比较计算的显著性水平:***P(P)=0.0002和****P(P)<0.0001(重量vs.KO)。

  5. E类

    对来自所示基因型骨骼肌线粒体的1D‐BNGE进行Western blot分析,每个通道显示一只动物的结果。

  6. F类

    对一个指定基因型个体骨骼肌线粒体的2D-BNGE进行Western blot分析。红色箭头表示COX组装中间体在密码1 −/−样品。

可在线获取此图的源数据。
图4
图4。线粒体亚定位APOPT公司1
  1. A类

    表达APOPT1的143B细胞不同组分SDS-PAGE的Western blotTot:总裂解物。细胞:线粒体后部分(细胞质)。Mt:分离线粒体。Mt sol:可溶性线粒体部分。线粒体膜:线粒体膜。合作2颗粒:用0.1 M Na进行碳酸盐萃取后的颗粒2合作,pH值10.5,持续30分钟。合作2sol:碳酸盐萃取后的可溶部分。

  2. B类

    洋地黄素处理后线粒体SDS-PAGE蛋白印迹用于蛋白酶保护试验。实验是在从表达APOPT1的143B细胞分离的线粒体中进行的暴露于越来越多的洋地黄素(以μg表示)和50μg/ml胰蛋白酶。使用1%Triton X-100的完全增溶作用作为蛋白酶敏感性的对照。TOM20:外膜转位酶(OM)20 kDa。ACO2:乌头糖2(线粒体亚型)。AIF:凋亡诱导因子。AK2:腺苷酸激酶2。OM:线粒体外膜。IM:线粒体内膜。IMS:膜间空间。

  3. C类

    低渗休克后用于蛋白酶保护测定的线粒体SDS–PAGE的蛋白质印迹。实验是在从表达APOPT1的143B细胞分离的线粒体中进行的在等渗(Iso)或低渗缓冲液中培养5分钟(Hypo 5′)或15分钟(Hybo 15′)和50μg/ml胰蛋白酶。用1%Triton X‐100完全溶解,作为蛋白酶敏感性的控制。

  4. D类

    N‐SIM超分辨率显微照片,显示0.8μm最大强度投影(每个0.15μmZ轴‐堆叠)表达APOPT1的143B细胞GFP公司以绿色显示每个线粒体隔室的特定标记:TOMM20(OM)、COX8A(IM)、MitoTracker(IM+M)和基质靶点(mCarlet)以红色显示。比例尺:5μM。该图显示了与APOPT1不同子隔间组合的共定位体积中的皮尔逊系数GFP公司数据显示平均值±SEM(n个 = 5). 单向方差分析(*P(P)=0.0298和**P(P)=0.0076)用于统计分析。

可在线获取此图的源数据。
图5
图5。有缺陷的考克斯组装和积累组装中间体APOPT公司1‐更少的人类细胞
  1. A类

    4月1日Western blot免疫可视化显示,在S6和S2永生化成纤维细胞中表达。在转导后的不同天检测其表达水平。右边的图表显示了每个细胞系三次生物复制中归一化为CS的CIV活性。数据以平均值±SEM表示(n个=3)。星号表示通过双向方差分析和Tukey多重比较测试计算的显著性水平:**P(P)=0.0030(S6幼稚vs.S6 APOPT1), *P(P)=0.0165(S6 EV与S6 APOPT1).

  2. B类

    4月1日GFP公司Western blot免疫可视化显示,在S6和S2永生化成纤维细胞中表达。右边的图表显示了在每个细胞系的四个生物复制中归一化为CS的CIV的活性。数据以平均值±SEM表示(n个 = 4). 星号表示通过双向方差分析和Tukey多重比较测试计算的显著性水平:**P(P)=0.0066(S6幼稚vs.S6 APOPT1GFP公司), ***P(P)=0.0006(S6 GFP与S6 APOPT1GFP公司), *P(P)=0.0169(S2幼稚vs.S2 APOPT1GFP公司)***P(P)=0.0008(S2 GFP与S2 APOPT1GFP公司).

  3. C类

    对从所示细胞系中提取的有丝分裂体的1D‐BNGE进行Western blot分析。用识别MT-CO1和MT-CO2的抗体对在200 kDa下迁移的完全组装的COX进行免疫可视化。还检测到组装中间体“MITRAC”和“S3”的存在(箭头所示)。

  4. D类

    从所示细胞系中提取的有丝分裂体2D‐BNGE的Western blot分析。用识别MT-CO1和MT-CO2的抗体对完全组装的COX进行免疫可视化。还检测到组装中间体“MITRAC”和“S3”的存在(箭头所示)。抗GFP免疫检测显示存在低分子量APOPT1GFP公司表达标记蛋白的补体细胞中的复合物。

  5. E类

    L‐[35S] 线粒体DNA编码蛋白质的蛋氨酸脉冲追踪标记。在用放射性标签(脉冲)照射2小时后,细胞在冷培养基中培养指定的追踪时间。这些图显示了在指定时间点归一化为ATP6波段的MT-CO1(左图)和MT-CO2+MT-CO3(右图)对应波段的密度定量。图表示每个细胞系的三个生物复制品的值。数据表示为平均值±SEM(n个=4(对于控件),n个=S2/S6/S2 APOPT1为2GFP公司/4月1日第6学期GFP公司). 符号表示通过双向方差分析和Tukey多重比较测试计算的显著性水平:MT‐CO1-3.5 h:*P(P)=0.0202(对照组vs.S2),†† P(P)=0.0039(对照组vs.S6);6.5小时:*P(P)=0.0118(对照组vs.S2),†† P(P)=0.0011(对照组vs.S6),§ P(P)=0.0163(S6与S6 APOPT1GFP公司); 20小时:***P(P)=0.0002(对照组vs.S2),†††† P(P)<0.0001(对照组vs.S6),# P(P)=0.0343(S2与S2 APOPT1GFP公司),§§§ P(P)=0.0007(S6与S6 APOPT1GFP公司). MT-CO2/MT-CO3-3.5小时:††† P(P)=0.0003(对照组vs.S6),§ P(P)=0.0194(S6与S6 APOPT1GFP公司); 6.5小时:§ P(P)=0.0375(S6与S6 APOPT1GFP公司); 20小时:**P(P)=0.0013(对照组vs.S2),†††† P(P)<0.0001(对照组vs.S6),# P(P)=0.0234(S2与S2 APOPT1GFP公司),§§§§ P(P)<0.0001(S6与S6 APOPT1GFP公司).

数据信息:C1和C2:对照永生化成纤维细胞。EV:用空载体转导的细胞。天真:非转基因永生化成纤维细胞。GFP:用重组GFP表达载体转导的细胞。如图所示,Tubulin、SDHB和SDHA被用作不同实验中的负荷控制。可在线获取此图的源数据。
图6
图6。蛋白酶体抑制和ROS公司生产过剩APOPT公司1稳定性
  1. A类

    MGM132处理的143B APOPT1的SDS-PAGE蛋白质印迹分析细胞。该图表示前体和成熟蛋白质信号的密度定量。

  2. B类

    面板上部(输入)显示了APOPT1的Western blot分析在MGM132处理的细胞中。注意,在用蛋白酶体抑制剂处理的样品中,长时间暴露后会出现高分子量条带。面板底部部分(纯化组分)显示了对同一细胞免疫沉淀抗-HA组分的分析。注意,高分子量物种与抗HA和抗泛素都发生交叉反应。

  3. C类

    过度表达标记APOPT1(如图所示)并暴露于100μM H的143B细胞总裂解物的SDS-PAGE蛋白质印迹分析2O(运行)2如图(H)所示2O(运行)2治疗)。这些图表表示每个时间点标记的APOPT1信号的密度定量。插图显示,APOPT1的增加发生在暴露于H后的最初几分钟2O(运行)2.

  4. D类

    对过度表达标记APOPT1(如图所示)并暴露于5μM米托百草枯(MitoPQ)的143B细胞总裂解物的SDS-PAGE进行Western blot分析,如方案(米托PQ治疗)所示,持续指定时间。这些图表表示每个时间点标记的APOPT1信号的密度定量。插图显示APOPT1的增加发生在暴露于MitoPQ后的最初几分钟。

可在线获取此图的源数据。
图7
图7。水户效应性能确认在没有或有APOPT公司1
  1. A类

    Western blot分析在指定时间用5μM MitoPQ处理的指定细胞系的总裂解液中不同线粒体蛋白的SDS-PAGE。UT:未经处理的细胞。

  2. B类

    APOPT1的密度定量GFP公司在两个生物复制品的处理过程中发出信号。数据表示为平均值±SEM(n个 = 2).

  3. C类

    非补体无APOPT1细胞(S6-GFP)与补体细胞(S6-APPT1)中MT‐CO1信号的密度定量GFP公司). 每个细胞系进行了三个生物复制品和两个技术复制品。UT S6 APOPT1中的信号被视为100%。数据表示为平均值±SEM(n个=3)。与未经处理的细胞相比,经MitoPQ处理20小时后,S6 GFP患者细胞中的MT‐CO1水平显著降低(*P(P)=0.0202,双尾非配对学生t吨‐测试)。

  4. D类

    非补体无APOPT1细胞(S6-GFP)与补体细胞(S6-APPT1)中MT‐CO2信号的密度定量GFP公司). 每个细胞系进行了三个生物复制品和两个技术复制品。UT S6 APOPT1中的信号被视为100%。数据表示为平均值±SEM(n个 = 3).

可在线获取此图的源数据。

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工具书类

    1. Abu‐Libdeh B、Douiev L、Amro S、Shahrour M、Ta‐Shma A、Miller C、Elpeleg O、Saada A(2017)COX4I1基因突变与身材矮小、体重增加差和染色体断裂增加有关,模拟范科尼贫血。《欧洲人类遗传学杂志》25:1142–1146-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Baertling F、Al-Murshedi F、Sanchez‐Caballero L、Al-Senaidi K、Joshi NP、Venselaar H、van den Brand MA、Nijtmans LG、Rodenburg RJ(2017)线粒体复合物IV亚基COX5A突变导致肺动脉高压、乳酸血症和发育不良。Hum变种38:692–703-公共医学
    1. Barrientos A(2003)人类线粒体疾病的酵母模型。IUBMB寿命55:83-95-公共医学
    1. Bourens M,Boulet A,Leary SC,Barrientos A(2014)人类COX20与SCO1和SCO2合作成熟COX2并促进细胞色素c氧化酶的组装。人类分子遗传学23:2901–2913-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bourens M,Barrientos A(2017a)CMC1基因敲除揭示了人类线粒体复合体IV生物发生的翻译独立控制。EMBO代表18:477–494-项目管理咨询公司-公共医学

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