A coronary artery disease-associated tRNAThr mutation altered mitochondrial function, apoptosis and angiogenesis

doi:10.1093/nar/gky1241

.2019年2月28日；47(4):2056-2074.

doi:10.1093/nar/gky1241。

冠状动脉疾病相关tRNAThre突变改变线粒体功能、凋亡和血管生成

附属公司

¹浙江大学医学院儿童医院医学遗传与基因组科，浙江杭州310058。
²浙江大学遗传学研究所和浙江大学医学院人类遗传学系，浙江杭州，310058，中国。
^三中国人民解放军总医院心脏科，北京100853。
⁴中华人民共和国教育部生殖遗传学重点实验室，浙江大学，浙江杭州，310058，中国。
⁵浙江大学与多伦多大学遗传与基因组医学联合研究所，浙江杭州，310058，中国。

PMID： 30541130
预防性维修识别码： PMC6393294型
内政部： 10.1093/nar/gky1241

冠状动脉疾病相关tRNAThre突变改变线粒体功能、凋亡和血管生成

贾紫东等。核酸研究. 2019.

.2019年2月28日；47(4):2056-2074.

doi:10.1093/nar/gky1241。

作者

贾紫东^1 2, Ye Zhang（叶张）², 李强², 叶振珍², 刘宇奇（Yuqi Liu）^三, 长住府², 仓晓慧^1 2, 孟旺（Meng Wang）^1 2, 民新馆^1 2 4 5

附属公司

¹浙江大学医学院儿童医院医学遗传与基因组科，浙江杭州310058。
²浙江大学遗传学研究所和浙江大学医学院人类遗传学系，浙江杭州，310058，中国。
^三中国人民解放军总医院心脏科，北京100853。
⁴中华人民共和国教育部生殖遗传学重点实验室，浙江大学，浙江杭州，310058，中国。
⁵浙江大学与多伦多大学遗传与基因组医学联合研究所，浙江杭州，310058，中国。

PMID： 30541130
预防性维修识别码： PMC6393294型
内政部： 10.1093/nar/gky1241

摘要

线粒体tRNA突变的组织特异性在很大程度上尚不清楚。在本研究中，我们证明了tRNAThre 15927G>A突变的有害作用，该突变有助于冠心病的发病机制。m.15927G>A突变消除了tRNAThre反密码子茎的高度保守的碱基配对（28C-42G）。通过分子动力学模拟，我们发现m.15927G>A突变导致了不稳定的tRNAStr结构，这是由熔融温度降低和突变tRNA电泳迁移速度变慢所支持的。通过将一个携带m.15927G>a突变的中国家系线粒体和一个对照基因转移到线粒体DNA（mtDNA）缺失的人脐静脉内皮细胞中构建的杂交细胞，我们证明m.15927G>a突变导致氨酰化效率和tRNAThre稳态水平显著降低。tRNAThre代谢异常导致mtDNA-编码多肽的可变减少、呼吸缺陷、膜电位降低和活性氧生成增加。m.15927G>A突变促进了细胞凋亡，表现为细胞色素c向胞浆中的释放增加，凋亡激活蛋白：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、7、9和PARP水平增加。此外，在突变杂交中观察到较低的伤口愈合细胞和扰动的管形成，表明血管生成发生改变。我们的发现为冠状动脉疾病的病理生理学提供了新的见解，这种疾病表现为tRNAThr突变诱导的改变。

©作者2018。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。

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数字

**图1。**
野生型和突变tRNA反密码干环的MD模拟^瑟. (A类)人线粒体tRNA的三叶结构^瑟(27–29).箭头指示m.15927 G>A突变的位置。(B类)野生型（黑线）和突变型（红线）tRNA的所有Cα原子的均方根偏差（RMSD）值的时间演变^瑟. (C类)从tRNA野生型（黑线）和突变型（红线）反密码子干环的主干原子生成RMSF曲线^瑟. (D类)野生型（棕色）和突变型（蓝色）tRNA反密码干环三级结构示意图^瑟.

**图2。**
体外构象、稳定性和t的分析⁶tRNA的A37修饰^瑟. (A类)变性和自然条件下通过PAGE分析评估构象变化。野生型（WT）和突变型（MT）tRNA的转录物^瑟通过天然或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用溴化乙锭染色。(B类)天然条件下tRNAs的Northern blot分析。将来自不同细胞系的两微克线粒体总RNA通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳，电印迹，并与特异于tRNA的DIG标记的寡核苷酸探针杂交^瑟，tRNA^谷氨酸，tRNA^伊斯和tRNA^遇见分别为。(C类)WT和MT tRNA的熔化曲线^瑟在260nm处以1°/min的升温速率从25°到95°测量转录物（红色曲线）。一阶导数（dA类/d日T型)显示了温度曲线，以突出显示T型_米值转换（绿色曲线）。(D类)体外t的测定⁶A37改装。未修饰的人类线粒体野生型（G42）和突变型（A42）tRNA^瑟生成自*在体外*转录。未经修饰的tRNA转录物与酵母Sua5和Qri7在[¹⁴C] 苏氨酸。分别在5、10、15或20分钟后取出样品并停止。从反应的初始阶段计算相对改性效率。计算基于三个独立的测定。图表显示了典型实验的结果。

**图3。**
变性条件下线粒体tRNA的Northern印迹分析。(A类)通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳不同细胞系的两微克线粒体总RNA，电印迹，并与针对tRNA的DIG标记寡核苷酸探针杂交^瑟，tRNA^赖氨酸，tRNA^谷氨酸，tRNA^{亮氨酸（CUN）}和tRNA^{序列（AGY）}分别为。(B类)tRNA水平的量化。平均tRNA^瑟每个细胞的含量，归一化为tRNA每个细胞的平均含量^赖氨酸，tRNA^谷氨酸，tRNA^{亮氨酸（CUN）}和tRNA^{序列号（AGY）}来自一名携带m.15927 G>A突变的受试者（IV-3）的三个杂交细胞系和来自同一mtDNA单倍型群（B5）但缺乏该突变的一名中国对照个体（HZC25）的三种杂交细胞系。杂交细胞系的值表示为对照细胞系平均值的百分比。计算基于三个独立的测定。误差条表示平均值的两个标准误差，水平虚线表示每组的平均值。*P（P）*根据t吨-突变体和对照杂交细胞系之间的差异测试。

**图4。**
氨酰化分析。(A类)体外转录的人线粒体突变体和野生型tRNA的氨酰化^瑟未修饰的人类线粒体野生型（G42）和突变型（A42）tRNA^瑟与人类TARS2在[¹⁴C] 苏氨酸。分别在5、10、15或20分钟后取出样品并停止。从反应的初始阶段计算相对氨基酰化效率。计算基于三个独立的测定。图表显示了典型实验的结果。(B类)体内氨酰化分析。在酸性条件下，通过酸性（pH 5.0）10%聚丙烯酰胺/8M尿素凝胶在4°C下对从不同细胞系纯化的2微克线粒体总RNA进行电滋养，电印迹并与针对tRNA的DIG标记寡核苷酸探针杂交^瑟然后剥离印迹，并用tRNA特异性探针重新杂交^伊利，tRNA^{亮氨酸（CUN）}和tRNA^{序列（AGY）}分别为。(C类)氨酰化tRNA的比例^瑟在突变体中，控制杂交细胞系和HUVEC。计算基于三个独立的测定。图3的图例中解释了图形细节和符号。

**图5。**
线粒体蛋白质的Western blot分析。(A类)将来自不同细胞系的5微克总线粒体蛋白通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电印迹，并与突变细胞系、对照细胞系和HUVECs中的9个呼吸复合物亚基杂交，其中TOM20作为负载对照。ND1、ND3、ND4、ND5和ND6表示还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶的亚基1、3、4、5和6；CYTB，脱细胞色素b条; 合作₂，细胞色素亚基IIc（c）氧化酶；ATP6和ATP8，H的亚单位6和8⁺-ATP酶。(B类)线粒体总蛋白水平的量化。HUVEC和六个杂交细胞系的线粒体蛋白质水平如其他地方所述（22–24）。突变杂交细胞系的数值表示为对照细胞系数值的百分比。计算基于三个独立的测定。(C类)9种多肽水平的量化。HUVEC和6个杂交细胞系中ND1、ND3、ND4、ND5、ND6、CYTB、CO2、ATP6和ATP8的水平如其他地方所述（22–24）。图3的图例中解释了图形细节和符号。

**图6。**
OXPHOS亚基的Western blot分析。(A类)通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来自不同细胞系的20微克总细胞蛋白，电印迹并与针对每个OXPHOS复合物亚基的抗体鸡尾酒杂交，以β-肌动蛋白作为负荷控制。(B类)ATP5A、UQCRC2、SDHB、CO水平的量化₂突变细胞系和对照细胞系中NDUFB8的测定如别处所述（52）。图3的图例中解释了图形细节和符号。

**图7。**
呼吸分析。(A类)O的分析₂在不同的细胞系中使用不同的抑制剂。首次测量2×10的耗氧率（OCR）⁴每个细胞系的细胞在基础条件下，然后在指定的时间连续添加寡霉素（1.5μM）、FCCP（0.8μM），鱼藤酮（3.0μM）和抗霉素A（1.5μM），以确定线粒体功能的不同参数。(B类)图中显示了HUVEC、突变和对照细胞系中的基础OCR、ATP-连锁OCR、质子泄漏OCR、最大OCR、储备容量OCR和非线粒体OCR。基础OCR测定为寡霉素前OCR减去鱼藤酮/抗霉素A后OCR。质子泄漏OCR被确定为基础OCR减去ATP-连锁OCR。最大OCR被确定为FCCP后的OCR减去非线粒体OCR。储备容量OCR定义为FCCP后最大OCR减去基础OCR之间的差异。鱼藤酮/抗霉素A治疗后，非线粒体OCR被确定为OCR。显示了每个细胞系6次测定的平均值。图形细节和符号在图3的图例中进行了说明。

**图8。**
线粒体膜电位分析。使用荧光探针JC-10分析系统，通过BD-LSR II流式细胞仪系统测量突变和对照杂交细胞系的线粒体膜电位（ΔΨm）。记录Ex/Em=488/590 nm和488/525 nm荧光强度的比值（FL590/FL525），以确定每个样品的ΔΨm水平。H25-03和IV-3-13的流式细胞术图像(A类)和(C类)FCCP公司。Ex/Em=490/530 nm和490/590 nm时JC-10荧光强度的相对比值(B类)缺席和(D类)存在10μM的FCCP。图3的图例中解释了图形细节和符号。

**图9。**
线粒体活性氧的测定。含或不含H的生命细胞中ROS生成水平之间的几何平均强度比率₂O（运行）₂刺激。采用BD-LSR II流式细胞仪系统，利用线粒体红超氧化物指示剂分析了三个突变杂交细胞系、三个对照细胞系和HUVEC的线粒体ROS生成速率。流式细胞术直方图显示H25-03（红色）和IV-3-13（绿色）的MitoSOX-红色荧光，无(A类)或使用(C类)H（H）₂O（运行）₂刺激。荧光强度的相对比值（用H刺激与未刺激₂O（运行）₂)计算结果：(B类)和(D类). 图3的图例中解释了图形细节和符号。

**图10。**
细胞凋亡分析。(A类)细胞色素的分布*c（c）*用细胞色素进行免疫荧光标记，从对照杂交细胞株（H25-03）、突变杂交细胞系（IV-3-13）和HUVEC中观察到*c（c）*通过共聚焦荧光显微镜分析与Alex Fluor 488（绿色）缀合的抗体。用红色和蓝色荧光分别鉴定线粒体和DAPI染色细胞核。(B类)通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电印迹，并与细胞色素杂交，对来自不同细胞系的20个总蛋白微结构进行电泳*c（c）*以β-肌动蛋白作为负载对照的抗体。(C类)细胞色素定量*c（c）*水平。细胞色素水平*c（c）*对照和突变细胞系如别处所述进行测定（53）。计算基于每个细胞系中的三个独立测定。(D类)通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳不同细胞系的20微克总蛋白，电印迹，并与裂解的PARP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、7和9抗体杂交，以β-肌动蛋白作为负荷对照。(E类)四种凋亡激活蛋白的定量。如别处所述，测定不同细胞系中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9、3、7和PARP的水平（52）。计算基于每个细胞系中的三个独立测定。图3的图例中解释了图形细节和符号。

**图11。**
伤口愈合试验。(A类)三个对照细胞系和三个突变杂交细胞系伤口愈合试验的代表性图像。抓伤后立即和受伤后24小时直接拍照。轮廓显示伤口的间隙区域。比例尺，100μm。(B类)伤口愈合率的量化。如别处所述，在受伤后24小时进行细胞迁移的定量测量（53）。计算基于每个细胞系中3-4个独立测定。图3的图例中解释了图形细节和符号。

**图12。**
试管形成试验。电池（1×10⁵)从三个对照组和三个突变杂交细胞中培养出细胞，用培养基重新悬浮，并将其装载在Matrigel顶部。在37°C下培养12小时后，在倒置显微镜下直接分析每个孔的试管形成。(A类)三个对照杂交种和三个突变杂交种在Matrigel上电镀16小时后形成试管的代表性光学显微照片(B类)使用血管生成分析仪（ImageJ）分析显微照片，用不同的颜色标记肾小管网络的不同结构，代表其自身特征：主节段（橙色）、网格（天蓝色）、由连接符号包围的节点（红色被蓝色包围）和分支（绿色）。(C类)用ImageJ血管生成分析仪定量分析毛细血管形成的特定参数。这些参数包括总管长度、节点数、连接数、主分段数、主线段总长度、网格数、总网格面积、分支数和总分支长度。数据表示每个细胞系的平均九个字段。比例尺，500μm。图3的图例中解释了图形细节和符号。

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1. Mathers C.D.、Loncar D.，2002年至2030年全球死亡率和疾病负担预测。《公共科学图书馆·医学》2006；3:e442。-项目管理咨询公司-公共医学
1. North B.J.，Sinclair D.A.，老龄化与心血管疾病的交叉点。循环。2012年决议；110:1097–1108.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Falk E.动脉粥样硬化的发病机制。美国大学J.Am.Coll。心脏病。2006年；47:7–12.-公共医学
1. Sing C.F.、Stengard J.H.、Kardia S.L.。基因、环境和心血管疾病。动脉血栓。瓦斯克。生物.2003；23:1190–1196.-公共医学

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[8] Falk E.动脉粥样硬化的发病机制。美国大学J.Am.Coll。心脏病。2006年；47:7–12.-公共医学

[9] Sing C.F.、Stengard J.H.、Kardia S.L.。基因、环境和心血管疾病。动脉血栓。瓦斯克。生物.2003；23:1190–1196.-公共医学

[10] Sing C.F.、Stengard J.H.、Kardia S.L.。基因、环境和心血管疾病。动脉血栓。瓦斯克。生物.2003；23:1190–1196.-公共医学

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