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.2019年2月1日；38（3）：e99360。
doi:10.15252/embj.201899360。 Epub 2018年12月11日。

疾病相关的tau通过抑制Parkin向线粒体的易位而损害有丝分裂

纳迪娅·康明斯 1, 安德烈亚·特威迪 1, 史蒂文·苏林 1, 耶稣·伯特伦·冈萨雷斯 1 2, 吉尔根·戈茨 三
附属公司

疾病相关的tau通过抑制Parkin向线粒体的易位而损害有丝分裂

纳迪娅·康明斯等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

蛋白tau的积累是阿尔茨海默病和其他tau病的特征，包括携带致病性tau突变的家族性额颞叶痴呆（FTD）。这些疾病的另一个标志性特征是功能失调的线粒体的积累。尽管已知与疾病相关的tau会损害线粒体功能的几个方面，但尚不清楚它是否也会直接影响线粒体质量控制，特别是帕金依赖性线粒体自噬。使用mito-QC线粒体吞噬报告，我们发现人类野生型（hTau）和FTD突变型tau（hP301L）都通过减少Parkin的线粒体易位来抑制神经母细胞瘤细胞的线粒体吞噬秀丽隐杆线虫神经系统中，hTau的表达降低了线粒体的吞噬作用，而hP301L的表达则完全抑制了它。这些影响并不是由于线粒体膜电位或细胞骨架的改变，因为tau通过将其固定在细胞液中而特异性地破坏了Parkin向缺陷线粒体的募集。这种隔离是由Parkin与τ投射域的异常相互作用介导的。由于线粒体在神经退行性疾病中功能失调，这些数据表明存在恶性循环，tau也抑制受损线粒体的降解。

关键词：秀丽线虫；阿尔茨海默病；自噬；线粒体。

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数字

图1
图1。Tau抑制N2a细胞的有丝分裂

  1. 表达线粒体QC的N2a细胞线粒体标记物ATPβ的免疫染色。

  2. 表达丝裂原-QC和myc‐Parkin的N2a细胞与hTau‐V5、hP301L-V5或空载体对照。CCCP（8μM，17 h）处理可诱导对照细胞发生有丝分裂，GFP/mCherry荧光比率降低，但hTau或hP301L细胞无此现象。反褶积（经典最大似然估计）仅用于显示图像。

  3. 量化每个细胞的GFP/mCherry荧光强度。数据通过双向方差分析进行分析，显示CCCP治疗的主要疗效，F类(1, 314) = 15.66,P（P）<0.0001和tau表达，F类(2, 314) = 12.26,P（P）<0.0001，以及显著的交互作用，F类(2, 314) = 6.137,P（P）= 0.0024,n个=40–73个细胞/组。

  4. 表达mito‐QC和myc‐Parkin以及hTau‐V5、hP301L‐V4或空载体对照的细胞，用抗霉素和寡霉素的混合物处理（AO，15μM，17 h）。

  5. 量化每个细胞的GFP/mCherry荧光强度。数据通过双向方差分析进行分析，显示AO治疗没有显著的主要影响，F类(1, 212) = 0.564,P（P）= 0.4534，或tau表达F类(2, 212) = 1.579,P（P）= 0.2087，但交互作用显著，F类(2, 212) = 9.854,P（P） < 0.0001,n个=16–50个细胞/组。

数据信息：数据以平均值和SEM表示*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ****P（P） < 0.0001用于简单效果。比例尺=（A）中的5μm和（B，D）中的10μm。可在线获取此图的源数据。
图EV1
图EV1。Tau的瞬时转染不会影响自噬通量
  1. A类

    表达GFP‐LC3和hTau、hP301L或对照载体的N2a细胞的代表性图像，这些细胞在HBSS中饥饿并用巴非霉素A（BAF）处理，说明BAF处理后LC3阳性自噬体增加。

  2. B类

    在用二甲基亚砜或BAF处理的饥饿细胞中，24小时tau表达后LC3阳性自噬体的定量。数据通过双向方差分析进行分析，说明BAF治疗的主要作用，F类(1, 135) = 10.3,P（P）= 0.0017，但tau表达无主要影响，F类(2, 135) = 0.5425,P（P）= 0.5826，无显著交互作用F类（2135）=0.6667，P（P）= 0.5151,n个=19–35个细胞/组。

  3. C类

    在tau表达24小时和CCCP治疗4小时后，对LC3阳性自噬体进行量化，表明tau对自噬体形成没有抑制作用。数据通过双向方差分析进行分析，说明CCCP治疗的主要效果，F类(1, 158) = 17.81,P（P） < 0.0001，但tau表达无主要影响，F类(2, 158) = 0.7444,P（P）= 0.4767，无明显交互作用F类（2158）=2.939，P（P）= 0.0558,n个=19–34个细胞/组。

  4. D、 E类

    LC3荧光强度与线粒体信号无关，表明缺乏共定位(第页= 0.125,P（P）= 0.4867),n个=33个单元格。

数据信息：数据以平均值和SEM表示**P（P） < 0.01, ****P（P） < 0.0001. 比例尺=10μm。可在线获取此图的源数据。
图2
图2。CCCP公司tau表达细胞中由Parkin转位至线粒体的功能受损

  1. 图像分析过程的图示。使用倒置的“Union Jack”查找表（LUT）更好地可视化GFP‐Parkin簇，然后手动选择这些簇作为感兴趣区域（ROI），并测量相应的线粒体荧光强度。

  2. 表达GFP‐Parkin和hTau、hP301L或空载体（对照）的N2a细胞的代表性图像持续24小时，然后用10μM CCCP处理4小时。

  3. 转染后24小时Parkin簇/细胞的定量。数据采用Kruskal–Wallis检验进行分析，χ2(2) = 8.18,P（P）= 0.0168，其次是邓恩事后（post-hoc）分析，n个=33–38个细胞/组。

  4. 转染后48小时Parkin簇/细胞的量化。数据采用Kruskal–Wallis检验进行分析，χ2(2) = 19.2,P（P） < 0.0001，其次是邓恩事后（post-hoc）分析，n个=37–55个细胞/组。

  5. 为了评估帕金簇和线粒体在转染后24小时的共定位，计算了帕金簇的平均归一化荧光强度与CCCP治疗后线粒体信号之间的Pearson相关性。控制第页= 0.616,P（P）= 0.0001; hTau公司第页= 0.217,P（P）= 0.2771; hP301L型第页= 0.548,P（P）= 0.0014 (n个=27–34个细胞/组）。

  6. 转染后48小时CCCP处理后Parkin簇平均归一化荧光强度与线粒体信号之间的Pearson相关性。控制第页= 0.434,P（P）= 0.0167; hTau公司第页= 0.128,P（P）= 0.4941; hP301L型第页= −0.299,P（P）= 0.2794 (n个=15–31个细胞/组）。请注意，（E）和（F）之间的不同强度刻度反映了图像的不同位深度。

数据信息：数据以平均值和SEM表示*P（P） < 0.05, ***P（P） < 0.001, ****P（P） < 0.0001. 比例尺=10μm。可在线获取此图的源数据。
图EV2
图EV2。线粒体靶点的泛素化减少马力301升

  1. 转染hTau、hP301L或空载体对照和myc‐Parkin 24小时并用CCCP处理4小时的N2a细胞的代表性图像。对线粒体（SOD2）和泛素进行免疫染色。比例尺=10μm。

  2. 通过评估线粒体ROI中线粒体泛素的荧光强度并计算其与全细胞泛素强度的倍数变化来量化线粒体泛素。数据通过双向方差分析进行分析，揭示了CCCP治疗的主要效果F类(1, 124) = 58.7,P（P） < 0.0001，τ物种无主要影响F类(2, 124) = 1.21,P（P）= 0.3004，交互作用显著F类(2, 124) = 7.16,P（P）= 0.0011. 数据以平均值和SEM表示**P（P） < 0.01, ****P（P） < 0.0001用于简单效果，n个=15–29个细胞/组。

可在线获取此图的源数据。
图EV3
图EV3。Tau和Parkin表达水平
  1. A类

    免疫印迹显示转染后24和48小时Tau‐V5和GFP‐Parkin的人群表达水平。

  2. B类

    免疫印迹中人类tau水平的定量。使用双向方差分析比较Tau水平，将对照组排除在统计分析之外，揭示了表达时间的主要影响，F类(1, 12) = 5.865,P（P）= 0.0322，τ物种的主要影响，F类(1, 12) = 14.66,P（P）= 0.0024且无交互作用F类(1, 12) = 1.187,P（P）= 0.2972.

  3. C类

    从免疫印迹定量GFP‐Parkin水平。使用双向方差分析比较Parkin水平，揭示了表达时间的主要影响，F类(1, 18) = 16.29,P（P）= 0.0008是tau物种的主要效应，F类(2, 18) = 4.249,P（P）= 0.0.308且无交互作用F类(2, 18) = 1.176,P（P）= 0.3313.

  4. D、 E类

    Parkin易位分析细胞中Tau的表达水平，以免疫染色后24小时的V5荧光强度表示（未配对t吨‐测试t吨= 1.412,P（P）= 0.1692）和48小时(t吨= 1.673,P（P）= 0.0979).

数据信息：数据以平均值和SEM形式给出*P（P） < 简单效果为0.05。可在线获取此图的源数据。
图3
图3。表达tau的细胞线粒体膜电位不变

  1. 罗丹明123负载细胞的FACS分析。计算几何平均荧光并表示为空载体控制的%。CCCP治疗队列作为阳性对照纳入，但未纳入统计分析。数据通过单向方差分析进行分析，F类(2, 14) = 0.196,P（P）= 0.8245.

  2. tau表达24小时后用CCCP处理的细胞的FACS分析。数据通过单向方差分析进行分析，F类(2, 15) = 0.434,P（P）= 0.6555. 显示DMSO阴性对照，但未进行统计分析。

  3. 装有罗丹明123的细胞的代表性点图。在未染色的细胞中设置门（黑线），以区分罗丹明阳性细胞（右半）和罗丹明阴性细胞（左半）。

数据信息：数据以平均值和SEM形式给出(n个=来自两个独立实验的5-6个样本/实验组）。可在线获取此图的源数据。
图4
图4。药理学上稳定细胞骨架并不能模拟tau对Parkin易位的影响

  1. hTau和hP301L瞬时表达后微管的免疫染色。

  2. 紫杉醇诱导微管结合的程度与tau表达的程度相似。

  3. CCCP和紫杉醇治疗后N2a细胞中Parkin簇的代表性图像和量化（Mann–WhitneyU型‐测试，单位= 22,448,P（P） < 0.0001,n个=仅CCCP和CCCP+紫杉醇分别为224、273个细胞/组）。

  4. 表达hTau和hP301L 24小时后乙酰化微管蛋白（Ace‐tubulin）的免疫印迹分析[单向方差分析，F类(2, 9) = 0.0432,P（P）= 0.9579].

  5. hTau和hP301L表达24小时后酪氨酸化微管蛋白（Tyr‐tubulin）的免疫印迹分析[单向方差分析，F类(2, 9) = 0.0402,P（P）= 0.9608].

  6. CCCP和肌动蛋白稳定剂Jasplakinolide（JPL；Mann–Whitney）治疗后N2a细胞中Parkin簇的代表性图像和量化U型‐测试，单位= 16,069,P（P） < 0.0001,n个=仅CCCP和CCCP+JPL分别为224、199个细胞/组）。

数据信息：数据以平均值和SEM表示****P（P）<0.0001。比例尺=10μm。可在线获取此图的源数据。
图5
图5。外源tau与Parkin相互作用，将其困在胞浆中
  1. A类

    V5标记的tau和GFP标记的Parkin的共免疫沉淀。V5标记用于下拉tau，并探测膜上的V5（使用不同物种中产生的抗体）和GFP。IP=免疫沉淀，Flow=去除珠子后流过裂解液。

  2. B类

    表达hTau‐GFP、hP301L‐GFP或GFP的细胞中tau和内源性Parkin的邻近连接分析（PLA）的最大投影图像。插入=阴性对照（tau和组蛋白H3的抗体，它们是未知的结合伙伴）。

  3. C类

    PLA信号在归一化为GFP信号的最大投影中的量化。结果采用Kruskal–Wallis检验进行分析，χ2(2) = 27.2,P（P） < 0.0001，其次是邓恩事后（post-hoc）分析以测试与GFP对照的差异，n个=GFP条件下的17个细胞，hTau条件下的14个细胞，以及hP301L条件下的27个细胞。

  4. D类

    PLA用于老年pR5小鼠的Parkin和hP301L以及一个窝友对照。

  5. E类

    PLA实验中使用的τ结构示意图。

  6. F、 G公司

    PLA用于Parkin和∆Tau，通过Tau的投影域揭示了相互作用。使用Mann–Whitney分析数据U型‐测试(单位= 185,P（P）= 0.9224,n个hTau和∆Tau分别为21、18个细胞/组）。

  7. H、 我

    PLA用于Parkin和微管结合域结构（MTBD）。使用t吨‐测试(t吨= 5.226,P（P） < 0.0001,n个hTau和MTBD分别为16、17个细胞/组）。

  8. J、 K（K）

    表达tau结构和GFP‐Parkin的细胞（24小时），有无CCCP治疗。对Parkin簇进行计数，说明Parkin易位受∆Tau的影响，但不受MTBD的影响。数据采用Kruskal–Wallis检验χ进行分析2(2) = 10.4,P（P）= 0.0056，其次是邓恩事后（post-hoc）,n个hTau、∆Tau和MTBD分别为67、42、53个细胞/组。

  9. L（左）

    在（K）中分析的每个细胞中的V5荧光强度（Mann–WhitneyU型‐测试，单位= 953,P（P）= 0.2332,n个∆Tau和MTBD分别为42、53个细胞/组）。

  10. M（M）

    用GFP‐Parkin和hTau‐V5、hP301L‐V4或空载体对照转染细胞，并用CCCP处理。对tau和Parkin进行了PLA。值得注意的是，在Parkin簇（箭头），tau和Parkin之间没有明显的相互作用。

  11. N个

    IMARIS中的3D重建，说明Parkin集群中缺少PLA信号。

数据信息：比例尺=10μm。数据以平均值和SEM表示**P（P） < 0.01, ****P（P） < 0.0001.可在线获取此图的源数据。
图6
图6。Tau抑制秀丽隐杆线虫神经元
  1. A类

    神经系统中丝裂原Rosella生物传感器的表达模式。

  2. B类

    线粒体分析管道秀丽线虫腹神经索。通过在dsRed通道中选择阈值来选择线粒体。该阈值用于在单个线粒体周围产生ROI，然后测量相应的GFP荧光强度。

  3. C、 天

    经NaN处理的转有丝分裂玫瑰花（而非tau）（WT）基因蠕虫的有丝分裂分析三（8 mM，1小时）或CCCP（15μM，2小时）。数据由非配对分析t吨‐测试，NaN三 t吨= 5.56,P（P） < 0.0001; CCCP公司t吨= 3.92,P（P）= 0.0002.

  4. E、 F类

    表达hTau的蠕虫对NaN反应的有丝分裂分析三治疗（未配对t吨‐测试，t吨= 1.62,P（P）= 0.1126）和CCCP治疗（Mann–WhitneyU型‐测试，单位= 113,P（P）= 0.002).

  5. G、 H（H）

    表达hP301L的蠕虫对NaN的反应的有丝分裂分析三（曼·惠特尼U型‐测试，单位= 126,P（P）= 0.2711）或CCCP（曼·惠特尼U型‐测试，单位= 375,P（P）= 0.3697）处理。

  6. 我

    使用人类τ特异性抗体HT7检测到的蛔虫裂解物中的Tau表达。

数据信息：n个=NaN的16–25个蠕虫/组三和23–39个蠕虫/组用于CCCP实验。数据以平均值和SEM形式给出***P（P） < 0.001, ****P（P） < 0.0001. 比例尺=10μm。（C、E和G）中的图像是腹索中少量线粒体的高倍放大图像；整个腹侧脊髓的例子如附录图S1所示。该图的来源数据可在线获取。
图EV4
图EV4。丝裂原Rosella的特征秀丽隐杆线虫以及毫伏337M‐Tau关于秀丽线虫神经元
  1. A类

    Mitotracker深红色染色显示Mitotracher（伪绿色以更好地可视化）和mito‐Rosella（dsRed）之间的共定位。比例尺=5μm。

  2. B类

    野生型蠕虫和pdr‐1（gk488）突变动物对NaN反应的有丝分裂分析三使用双向方差分析对数据进行分析，揭示了基因型的主要影响F类(1, 106) = 6.415,P（P）= 0.0128; NaN的主要作用三治疗F类(1, 106),P（P）= 0.047; 和显著的交互作用F类(1, 106),P（P）= 0.0041;n个=26–29只动物/组。

  3. C、 天

    表达hV337M‐Tau的蠕虫对NaN反应的有丝分裂分析三（曼·惠特尼U型‐测试，单位= 25,P（P） < 0.0001,n个=16，车辆和NaN为19三和CCCP治疗（未配对t吨‐测试，t吨= 0.8113,P（P）= 0.4211,n个=25，DMSO和CCCP分别为27）。

  4. E类

    用人Tau特异性抗体HT7检测蠕虫裂解物中的Tau表达（图6I中的扩展免疫印迹）。

数据信息：数据以平均值和SEM形式给出**P（P） < 0.01, ****P（P） < 0.0001. 比例尺=10μm。可在线获取此图的源数据。
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