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.2019年1月25日;294(4):1363-1379.
doi:10.1074/jbc。RA118.005993。 Epub 2018年12月6日。

O(运行)-GlcNAc稳态有助于造血过程中的细胞命运决定

附属公司

O(运行)-GlcNAc稳态有助于造血过程中的细胞命运决定

Zhen Zhang先生等。 生物化学杂志. .

摘要

添加单个β-d-GlcNAc糖(O(运行)-GlcNAc)由O(运行)-GlcNAc转移酶(OGT)和O(运行)-GlcNAc去除方法O(运行)-GlcNAcase(OGA)维持体内平衡O(运行)-细胞蛋白的GlcNAc水平。蛋白质的变化O(运行)-GlcNAcylation调节细胞分化和细胞命运决定,但这些变化如何影响红细胞生成,这是血细胞形成的一个基本过程,尚不清楚。在这里,我们研究了O(运行)-G1E-ER4细胞携带红系特异性转录因子GATA结合蛋白1(GATA-1)与雌激素受体(GATA-1-ER)融合,因此在β-雌二醇(E2)添加。我们观察到,在G1E-ER4分化过程中O(运行)-GlcNAc水平降低,GATA-1与OGT和OGA的物理相互作用增加。在OGA抑制剂Thiamet-G(TMG)存在下分化的G1E-ER4细胞的基于RNA-Seq的转录组分析显示433个GATA-1靶基因的表达发生了变化。ChIP结果表明,TMG处理降低了溶酶体蛋白跨膜5的GATA结合位点GATA-1、OGT和OGA的占有率(第5圈)基因启动子。TMG还降低了NB4和HL60人类髓系白血病细胞分化相关基因的表达,这表明O(运行)-GlcNAcylation参与造血分化的调节。在分化前用TMG持续治疗G1E-ER4细胞可减少血红蛋白阳性细胞并增加干/祖细胞表面标记物。我们的结果表明O(运行)-GlcNAcylation干扰控制红细胞生成谱系承诺的转录程序,提示其在红细胞生成中的作用O(运行)-GlcNAcylation调节造血细胞命运。

关键词:雾-1;G1E-ER4;GATA转录因子;O-GlcNA酰化;O-连接N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)转移酶(OGT);区别;红细胞生成;基因调控;造血;骨髓生成;翻译后修饰;转录。

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数字

图1。
图1。
O(运行)-GATA-1活性恢复后,GlcNAc水平下降。用TMG(OGA抑制剂)和/或E处理G1E和G1E-ER4细胞2持续30小时。经过一段时间后收获细胞()或30小时((f)). 对全细胞裂解物进行免疫印迹。相对OGA(b条c(c))和OGT(e(电子))G1E蛋白水平(b条)和G1E-ER4(c(c)e(电子))通过ImageJ 1.49v进行量化。*表示第页与0小时相比<0.05。G1E-ER4(小时)和G1E(j个)细胞接受May-Grünwald Giemsa(MGG公司)染色()用于细胞形态和联苯胺染色(BZ公司) (小时j个)血红蛋白含量。这个红箭显示血红蛋白阳性细胞。k个,β的转录水平专业-珠蛋白基因(血红蛋白-b1)通过RT-qPCR测定β-肌动蛋白(Actb公司)被用作内部控制。代表裁剪过的斑点。*表示第页与0小时相比<0.05,***表示第页与对照组相比<0.001。误差线代表S.E。工作分解结构,Western blotting。
图2。
图2。
持续OGA抑制调节红细胞生成基因表达。TMG与E同时加入G1E-ER4细胞2归纳。治疗为急性(72小时)或长期(2周)。对E进行流式细胞术分析2-仅(未显示数据),E2+急性TMG()和长期TMG治疗(2周(2周))+E(英语)2(b条). 在0和72小时制备E的全细胞裂解物2-仅长期TMG治疗+E2并进行免疫印迹(c(c)). May-Grünwald Giemsa对细胞进行组织学分析(MGG公司)染色()用于细胞形态和联苯胺染色(BZ公司) (e(电子))血红蛋白含量。β的转录水平专业-珠蛋白基因(血红蛋白-b1) ((f)),第5圈()、和Fndc5公司(小时)RT-qPCR检测;核糖体蛋白L-7用作内部对照。表示裁剪的斑点。所有实验都是用至少三个生物复制品进行的。误差线代表S.D。工作分解结构,Western blotting。
图3。
图3。
TMG治疗可改变中性粒细胞样分化。用ATRA±TMG诱导NB40或HL60细胞分化。在48小时时收集细胞,并对全细胞裂解物进行免疫印迹(). 基因转录水平CTSD公司(b条)和DEFA1公司(c(c))用qPCR分析ATRA处理诱导的小鼠。实验重复了三次。GAPDH被用作内部控制。误差线代表S.E。Ctrl键,控制。
图4。
图4。
GATA-1与G1E-ER4细胞中的OGT和OGA相互作用。用TMG处理G1E-ER4细胞(T型)和/或E230 h。收集细胞并进行IP处理。O(运行)-GlcNA酰化蛋白、OGT、OGA和GATA-1–ER用特异性免疫沉淀O(运行)-GlcNAc抗体(RL2)()和OGT(b条)、OGA(c(c))和GATA-1()抗体。分别用RL2、GATA-1、FOG-1、OGT、OGA和GAPDH检测印迹。同位素(正常兔或鼠IgG)IP和抗体沉淀(1°)作为阴性对照。使用40微克的总裂解物作为输入。所有实验都是用至少三个生物复制品进行的。表示裁剪的斑点。工作分解结构、Western blotting;Ctrl键,控制。
图5。
图5。
抑制OGA会改变红细胞生成过程中的基因转录网络。向下的维恩图()并上调(b条)TMG、E中的转录本2、和E2+分别显示了急性TMG治疗与对照组的比较。带a的成绩单第页分析中包括值<0.05和FDR<0.05(c(c)). 前10名-(顶部)并下调(底部)GSEA分析的生物过程根据归一化富集分数进行排序(NES公司)对于TMG+E2–和E2仅经处理的G1E-ER4细胞(). E的富集图2+急性TMG–和E2只有经过处理的G1E-ER4细胞显示出上调的髓系白细胞活化生物过程(左边)和下调生物过程tRNA代谢过程(正确的). A标称值(笔名)第页值<5%和FDRq个值<25%用于生物过程分析。
图6。
图6。
O(运行)-GlcNAc在红细胞生成过程中调节GATA-1靶基因转录。火山图显示E中差异表达的基因2+急性TMG治疗与E2-只有治疗(). 每个黑点表示RNA-Seq分析中的单个基因,负对数为第页在上绘制的值y轴,以及-折叠变化的日志(常设费用)绘制在X轴1173个基因在大肠杆菌中差异表达2+急性TMG治疗与E2只有治疗和四个基因(第5圈,Fndc5公司,第14部分、和Mvb12a型)中突出显示了感兴趣的红色饼图显示了差异表达的上调(45%)和下调(55%)基因的分布(b条). 成绩单第页数值<0.05和FDR<0.05被包括在分析中。热图显示了前20个差异表达基因(c(c)). 维恩图显示1173个基因的差异表达(E2+急性TMG治疗E类2-仅治疗)和数据库中的4072个GATA-1靶基因。在433个差异表达的GATA-1靶基因中,243个基因上调,190个基因下调().
图7。
图7。
的验证O(运行)-GlcNAc通过RT-qPCR调控GATA-1靶基因。GATA-1靶基因的转录水平第5圈(),Fndc5公司(b条),第14部分(c(c))、和Mvb12a型()用E处理细胞后用RT-qPCR进行分析2+急性TMG或E2只有。实验重复了四次。β-肌动蛋白(Actb公司)被用作内部控制。误差线代表S.D。Ctrl键,控制。
图8。
图8。
抑制OGA可降低GATA-1–ER、OGT、OGA和O(运行)-GlcNAc水平第5圈GATA结合位点。GATA-1协议()、OGT(b条)、OGA(c(c))、和O(运行)-GlcNAc(RL2)()使用经E处理的G1E-ER4细胞进行ChIP分析2+急性TMG或E2只有。ChIP DNA通过qPCR分析,使用一组针对第5圈GATA结合位点(+8kb TSS)和+58kb TSS。正常兔IgG作为阴性对照。所有实验都是用至少三个生物复制品进行的。纳秒,不显著。误差线代表S.D。Ctrl键,控制。
图9。
图9。
红细胞生成过程中OGT/OGA介导的GATA-1靶基因激活/抑制模型。E恢复GATA-1后2,GATA-1转录激活物/阻遏物复合物(黄色圆圈)被招募到位于顺式-导致其表达的基因调控区(GATA-1基因激活/抑制的通用模型)(). GATA-1靶基因的一个子集利用OGT/OGA作为转录复合体的组成部分,在正常生理条件下激活/抑制GATA-1目标基因。这个红箭表示GATA-1结合位点的OGT、OGA和GATA-1数量增加(b条). 当OGA被TMG抑制时,O(运行)-激活/阻遏复合物处的GlcNAc循环减少(黑色小箭头). 尽管OGT、OGA和GATA-1复合物在GATA-1结合位点的占有率降低,但其余复合物看起来更稳定,导致GATA-1介导的基因激活/抑制增强(c(c)).

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