uPARAP/Endo180 receptor is a gatekeeper of VEGFR-2/VEGFR-3 heterodimerisation during pathological lymphangiogenesis

doi:10.1038/s41467-018-07514-1

.2018年12月5日；9(1):5178.

doi:10.1038/s41467-018-07514-1。

uPARAP/Endo180受体是病理性淋巴管生成过程中VEGFR-2/VEGFR-3异源二聚体的看门人

附属公司

¹比利时列日希波克拉特大街13号B23列日大学肿瘤与发育生物学实验室，GIGA（GIGA-Cancer）。
²比利时列日市希波克拉特大道13号B23，4000，列日大学GIGA-Cancer结缔组织生物学实验室。
³芬兰赫尔辛基大学赫尔辛基生物医学Wihuri研究所和转化癌症生物学项目，邮编：00014。
⁴比利时列日，4000，CHU列日，妇产科。
⁵Finsen实验室/BRIC，Rigshospitalet/哥本哈根大学，Jagtvej 1242200，丹麦哥本哈根。
⁶比利时列日市希波克拉特大道13号B23，4000，列日大学GIGA-Cancer分子血管生成实验室。
⁷比利时列日希波克拉特大街13号B23列日大学肿瘤与发育生物学实验室，GIGA（GIGA-Cancer）。agnes.noel@uliege.be。

PMID： 30518756
预防性维修识别码：项目经理6281649
内政部： 10.1038/s41467-018-07514-1

uPARAP/Endo180受体是病理性淋巴管生成过程中VEGFR-2/VEGFR-3异二聚作用的看门人

塔妮娅·杜雷等。国家公社. 2018.

.2018年12月5日；9(1):5178.

doi:10.1038/s41467-018-07514-1。

附属公司

¹比利时列日希波克拉特大街13号B23列日大学肿瘤与发育生物学实验室，GIGA（GIGA-Cancer）。
²比利时列日市希波克拉特大道13号B23，4000，列日大学GIGA-Cancer结缔组织生物学实验室。
³芬兰赫尔辛基大学赫尔辛基生物医学Wihuri研究所和转化癌症生物学项目，邮编：00014。
⁴比利时列日，4000，CHU列日，妇产科。
⁵芬森实验室/BRIC，Rigshospitalet/哥本哈根大学，Jagtvej 124，2200，哥本哈根，丹麦。
⁶比利时列日市希波克拉特大道13号B23，4000，列日大学GIGA-Cancer分子血管生成实验室。
⁷比利时列日希波克拉特大街13号B23列日大学肿瘤与发育生物学实验室，GIGA（GIGA-Cancer）。agnes.noel@uliege.be。

PMID： 30518756
预防性维修识别码：项目经理6281649
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摘要

通过VEGF-C与其受体VEGFR-2和VEGFR-3的结合，在许多癌症和炎症疾病中出现新的淋巴管。淋巴管内皮细胞（LECs）中VEGFR-2/VEGFR-3异源二聚体及其下游信号的调控尚不清楚。在这里，我们确定内吞受体uPARP是调节其异二聚体形成的VEGFR-2和VEGFR-3的伴侣。uPARP的基因消融导致病理条件下的淋巴管超支化，而不影响伴随的血管生成。在体外，uPARAP控制LEC对VEGF-C的迁移，但不控制VEGF-A或VEGF-CCys156Ser。uPARAP限制VEGFR-2/VEGFR-3异二聚体以及随后VEGFR-2介导的磷酸化和Crk-II适配器失活。uPARP通过Crk-II/JNK/paxilin/Rac1途径促进VEGFR-3信号传导。uPARAP敲除小鼠的药理学Rac1抑制恢复了野生型表型。总之，我们的研究确定了淋巴管生成的分子调控因子，并揭示了病理条件下VEGF-C驱动的LEC萌芽过程中VEGFR-2/VEGFR-3串扰和下游信号的新分子特征。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
*uPARAP公司*缺乏导致烧灼角膜中的超支淋巴管和肿瘤淋巴管生成。一–**c（c）**第3天角膜的整体免疫荧光(一)和第5天(b条,**c（c）**)在热烧灼诱导后*uPARAP公司*KO和WT小鼠(n个 = 6). 酒吧 = 1 mm和500 在左侧和右侧（插入物的放大倍数较高）图像中分别为µm。直方图对应于发芽数量的计算机量化(一,n个 = 6角膜），分叉(一,b条 n个 = 6角膜），终点(b条 n个 = 6角膜）和环结构（红色，**c（c）** n个 = 5角膜）。d日淋巴芽的丝状延伸（箭头）。蓝色染色对应于to-PRO3染色的细胞核检测。酒吧 = 200 微米。对10张图片进行量化。**e（电子）**使用浸有PyMT肿瘤细胞的明胶海绵进行耳海绵检测的示意图。白点勾勒出耳朵里的海绵。直方图表示通过计算机辅助方法量化的血管面积密度(n个 = WT为10；n个 = 7代表KO）。酒吧 = 500 微米。**（f）**厚切片（150）上观察到的环状结构（红色）证明了血管系统的复杂性微米）(n个 = 7). 所有结果均表示为平均值 ± 使用非参数Mann-Whitney检验进行SEM和统计分析**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01和*****P（P）* < 0.0001

图2
*uPARAP公司*缺乏刺激VEGF-C驱动的淋巴管生成。一VEGF配体与VEGFR-2和VEGFR-3同二聚体或VEGFR-2/VEGFR-3异二聚体相互作用示意图。b条–**e（电子）**PBS浸泡的明胶海绵(b条)、VEGF-C(**c（c）**)、VEGF-A(d日)或突变的VEGF-C_{Cys156Ser系列}(**e（电子）**)植入小鼠耳朵。白点勾勒出耳朵里的海绵。淋巴管用LYVE-1（绿色）免疫染色检测。直方图表示通过计算机辅助方法量化的血管面积密度，并表示为WT控制的百分比(b条–d日 n个 = 6;**e（电子）** n个 = 8). 酒吧 = 500 微米。**（f）**VEGF-C浸泡海绵的吲哚青绿（ICG）清除率*uPARAP公司*使用异种IVIS的WT和KO小鼠。直方图表示在每个时间点检测到的平均荧光信号(n个 = 5). 所有结果均表示为平均值 ± 使用非参数Mann-Whitney检验进行SEM和统计分析**P（P）* < 0.05和***P（P）* < 0.01

图3
uPARAP由人和小鼠LEC表达。一用Western Blot法检测分离自*uPARAP公司*-熟练（WT）和缺陷（KO）小鼠。b条人LEC与来自指定肿瘤细胞系的条件培养基孵育，并进行uPARP的Western Blot。GAPDH被用作负荷控制。**c（c）**人类肿瘤性宫颈和乳腺组织连续切片上淋巴管（粉红色，D2-40）和uPARP（棕色）的免疫染色。酒吧 = 50 µm（上部和中部面板）和25 µm（下面板）

图4
uPARAP下调损害LEC向VEGF-C梯度的趋化迁移。用靶向uPARAP的siRNA（siU1和siU2）或对照siRNA（Ctr）转染LECs。逆转录聚合酶链反应(一)和Western印迹(b条)uPARP、VEGFR-3和VEGFR-2表达分析（28S和GAPDH = 内部控制）。**c（c）**VEGF-C或VEGF-A刺激后增殖。数据为三种代表性分析中的一种(n个 = T0和n个 = T48小时为8，生物复制）。d日在有对照介质的情况下进行划痕试验(n个 = 10）、VEGF-C(n个 = 10）或VEGF-A(n个 = 3）（在所有条件下进行生物复制）。**e（电子）**Ibidiµ-载玻片中向VEGF-C或VEGF-a梯度迁移的LECs的Phalloidin和uPARAP染色。酒吧 = 25 左图像中的µm和50 右侧图像中的µm（插入物的放大倍数更高）。**（f）**在对照培养基、野生型VEGF-C、VEGF-A或突变型VEGF-C存在下的Boyden Chamber试验_{Cys156Ser系列}直方图对应于平均值(n个 = 6用于控制介质，VEGF-C和VEGF-A，以及n个 = 3用于突变的VEGF-C_{Cys156Ser系列}，生物复制） ± 扫描电镜。克对完全培养基（VEGF-C或VEGF-a）梯度的趋化反应。玫瑰图代表30多个细胞的迁移方向。黑色箭头表示平均迁移方向。VEGF-C图中没有箭头反映了uPARP沉默后方向性受损。直方图表示迁移速度（µm/min），其中结果表示为平均值(n个 = 完整培养基和VEGF-C的6个生物复制品；n个 = VEGF-A的3个生物复制品） ± SEM。使用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析**P（P）* < 0.05和***P（P）* < 0.01

图5
uPARAP与VEGFR-2和VEGFR-3形成复合物，并限制VEGFR-2/VEGFR-3异二聚体。LEC中的原位PLA(一,b条,**e（电子）**–我)或PAEC(d日)是否刺激5（T5）和30 VEGF-C的最小值（T30）(一,b条,**e（电子）**–克).一,b条uPARP与VEGFR-2的相互作用(一)或VEGFR-3(b条). 结果是3个代表性化验中的一个化验结果。数据表示平均值（生物复制品，20张图像进行量化分析） ± 扫描电镜棒材 = 10 微米。**c（c）**在VEGF-C刺激的指定时间点uPARAP的免疫沉淀（IP）。Western blot显示了针对VEGFR-2、VEGFR-3（上面板）或uPARP（下面板）的抗体（IB）。GAPDH被用作负荷控制。d日在基础条件下，在表达VEGFR-2（PAEC-VEGFR-2）、VEGFR-3（PAEC-FEGFR-3）或不表达VEGFR（PAEC）的PAEC中，原位PLA检测uPARP与VEGFR-1或VEGFR-4的相互作用。酒吧 = 10 微米。**e（电子）**,**（f）**原位PLA检测对照LECs（Ctr）中VEGFR-2/VEGFR-3异源二聚体，uPARAP表达缺陷的LEC（siU1和siU2）(**e（电子）**)或LECs过度表达uPARAP（uPARAPcDNA）(**（f）**).克转染VEGFR-3-标记cDNA的LEC中VEGFR-3同源二聚体。数据对应于平均值（生物三倍体，分析60张图像进行量化，每个条件分析>100个细胞） ± 扫描电镜(**e（电子）**–克).小时以VEGF-C梯度迁移的LECs中uPARAP/VEGFR-2和uPARAP/VEGFR-3复合物的原位PLA检测。酒吧 = 20 微米。我原位PLA检测以VEGF-C梯度迁移的对照LECs（Ctr）和uPARAP沉默的LEC（siU）中的VEGFR-2/VEGFR-3异二聚体。左直方图对应于每个单元格的平均点数。右直方图表示PLA相对于细胞核的信号定位（三个代表性实验中的一个，每个实验中每个条件分析25个细胞）。酒吧 = 20 微米。采用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析。我采用卡方检验**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01，以及****P（P）* < 0.001

图6
uPARAP下调损害Crk/JNK/paxilin通路。一,b条,d日–**（f）**用靶向uPARAP的siRNA（siU1和siU2）或对照siRNA（Ctr）处理LEC，并用VEGF-C刺激指定时间（分钟）。一–**（f）**总和磷酸化（p）VEGFR-2（Y1175）、VEGFR-3（Y1230/31）的Western blot(一)、ERK、AKT、JNK(b条,**c（c）**)、Crk(**d、 e（电子）**)和帕罗西林（Y118，S178）(**（f）**).c（c）表达uPARP的PAEC通过携带完整（WT）或突变（VEGFR-3）的质粒转染_Y1063楼)VEGFR-3 cDNA。VEGF-C刺激后用Western blot检测JNK磷酸化。d日,**e（电子）**用VEGFR-2抑制剂（ZM323881）或抗VEGFR-2的siRNA（siR2）处理LECs（+ZM）或不处理（-ZM）。对于Western blot带密度的量化，数值计算为磷酸化与总形态的比率，并归一化为对照组获得的数值（Ctr）(n个 = 生物复制）。采用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析**P（P）* < 0.05

图7
uPARAP下调在VEGF-C刺激下诱导Rac1过度激活。一,b条Cdc42公司(一)和Rac1(b条)uPARAP沉默（siU）或对照（Ctr）LECs中的时程激活。对于下拉定量，计算值为Rac1-GTP与总Rac1形式的比值，并将其归一化为对照组获得的值（Ctr）(n个 = 生物复制）。**c（c）**将浸有VEGF-C的明胶海绵植入小鼠耳内。海绵注射或不注射Rac1抑制剂NSC 23766（NSC）。淋巴管用LYVE-1（绿色）免疫染色检测。酒吧 = 500 微米。直方图表示通过计算机辅助方法量化的血管面积密度，并表示为WT控制的百分比。值对应于平均值(n个 = 10) ± SEM。使用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01，以及****P（P）* < 0.001

图8
拟议模型的示意图。一在没有uPARAP的情况下，VEGFR-2/VEGFR-3异二聚体被促进，导致VEGFR-2的Crk磷酸化，从而损害其与伙伴（JNK和paxillin）的相互作用。在体内没有uPARP的情况下可以观察到超支化淋巴管。b条uPARAP起到了守门人的作用，限制了VEGFR-2/VEGFR-3异二聚体和随后的Crk磷酸化，Crk磷酸化成了伙伴之间增强JNK信号的桥梁

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