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.2018年11月30日；9（1）:5083。
doi:10.1038/s41467-018-07497-z。

ROBO2是胰腺中的基质抑制基因，通过TGF-β信号传导发挥作用

安德烈亚·五·皮尼奥 1 2 三, 马蒂亚斯·范·布尔克 4, 洛兰·钱特里尔（Lorraine Chantrill） 5 6 7, 梅伦·阿尔西 5 6, 塔蒂亚娜·斯利亚罗娃（Tatyana Sklyarova） 4, 大卫·赫尔曼 5 6 7, 克莱尔·维宁 5, 大卫·加列戈·奥尔特加 5 7, 阿曼达·莫森 5 6, 马克·吉里·拉特里尔 5 6, 阿斯特里德·马吉诺 5, 冈瑟·勒克斯 8, 吕克·拜因斯 8, 安东尼·吉尔 5 6 9, 菲比·菲利普斯 10, 保罗·汀普森 5 6 7, 安德鲁·V·比安金 6 11 12 13, 吴建民 6 14, 伊尔斯·鲁曼 15 16
附属公司

ROBO2是胰腺中的基质抑制基因，通过TGF-β信号传导发挥作用

安德烈亚·皮尼奥等。 国家公社. .

摘要

尽管SLIT-ROBO通路的基因组畸变在胰腺导管腺癌（PDAC）中很常见，但其在胰腺中的功能尚不清楚。在这里，我们报告了在胰腺炎和PDAC小鼠模型中，上皮Robo2表达缺失，而Robo1表达在基质中最为显著。上皮细胞Robo2（Pdx1）缺失小鼠的细胞培养Cre公司；机器人2前/后)显示Robo1的激活增加+肌成纤维细胞和TGF-β和Wnt通路的诱导。胰腺炎期间，Pdx1Cre公司；机器人2前/后小鼠表现出增强的肌成纤维细胞活化、胶原交联、T细胞浸润和致瘤免疫标记物。TGF-β抑制剂galunisertib抑制这些作用。在PDAC患者中，ROBO2的表达总体较低，而ROBO1在上皮中可变表达，在基质中高表达。ROBO2公司低的；ROBO1公司高的患者存活率最低。总之，Robo2通过抑制肌成纤维细胞活化和T细胞浸润，以非自主方式作为基质抑制基因发挥作用。PDAC患者ROBO1/2的表达可能指导TGF-β抑制剂或其他基质/免疫调节剂的治疗。

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图1
图1
胰腺炎和PDAC中Robo1/2表达的细胞类型特异性变化。一——c（c）通过RNA原位杂交（RISH）分析Robo1和Robo2 mRNA的表达一正常小鼠胰腺（NMP），b条急性胰腺炎（AP）和c（c）克拉斯的PDAC样品G12D系列; Trp53基因172H兰特; Pdx1页Cre公司（KPC）动物。注意，点强度与mRNA拷贝的数量无关。虚线表示组织学分区（腺泡，Ac；导管，Du；肿瘤上皮，Epi；间充质细胞，Me）。图像是六个独立实验的代表。比例尺对应20 微米。d日NMP、AP和PDAC组织切片中Robo1 RISH的量化。以平均值表示的数据 + /− 扫描电镜；N个 = 6.使用未配对的t吨用威尔士语的纠正进行测试***P（P） < 0.001.e（电子）NMP、AP和PDAC组织切片中Robo2 RISH的定量。以平均值表示的数据 + /− 扫描电镜；N个 = 6.使用未配对的t吨用威尔士语的纠正进行测试*P（P） < 0.05.（f）RISH-Robo1和Robo2与NMP中上皮标记E-cad和间充质标记Vim的免疫荧光多路复用。红色箭头表示Robo1+和机器人2+信号。细胞核用DAPI染色。图像是六个独立实验的代表。比例尺对应20 微米。使用20倍放大率和3.5倍变焦获得共焦照片。克Robo1或Robo2与PDAC（KPC模型）中上皮标记E-cadherin（E-cad）和间充质标记vimentin（Vim）的RISH-免疫荧光多路复用。细胞核用DAPI染色。图像是三个独立实验的代表。比例尺对应20 微米。使用20倍放大率和缩放2.0获得共焦照片
图2
图2
Robo2细胞培养中肌成纤维细胞增加前/后胰腺。一Pdx1的代表性图像Cre公司和机器人2前/后培养第8天（D8）进行胰腺外分泌原代培养。比例尺对应200 微米。b条用硫罗丹明B染色定量测定48岁时的细胞附着 培养基h。c（c）Pdx1 D8原代胰腺培养物中间充质标志物Vim和上皮标志物E-cad的免疫荧光染色Cre公司和机器人2前/后动物。图像是五个独立实验的代表。细胞核用DAPI染色。使用40倍放大率获得共焦图像。比例尺对应50 微米。d日RT-qPCR分析D8原代胰腺Pdx1培养中胰腺上皮标记物的mRNA表达Cre公司和机器人2前/后动物。e（电子）D8原代胰腺Pdx1培养中间充质标志物Vim和αSma的免疫荧光染色Cre公司和机器人2前/后动物。图像是五个独立实验的代表。细胞核用DAPI染色。使用40倍放大率获得共焦图像。比例尺对应50 微米。（f）RT-qPCR分析D8原代胰腺Pdx1培养中间充质细胞和星状细胞标记物的mRNA表达Cre公司和机器人2前/后动物。所有qPCR数据均参考家政基因Hprt。克FACS分类上皮（EpCAM）的定量+，Cd31−和Cd140a−)和间充质（Cd140a+，Cd31−和EpCAM−)Pdx1的D8原代胰腺培养细胞群Cre公司和机器人2前/后动物。小时用10聚合酶链反应分析Cre介导的Robo2等位基因重组 从FACS分类的Pdx1的D8原代胰腺培养物中提取基因组DNACre公司和机器人2前/后动物。箭头表示未重组（1390 bp）和重组（1180 bp）扩增子。N或R表示使用的是哪对引物。N个对于Robo2野生型等位基因引物对，R表示Robo2敲除等位基因的引物对。所有数据均表示为平均值 + /− 扫描电镜；N个 ≥ 5.使用unparied进行统计分析t吨韦尔奇校正测试*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图3
图3
Robo2细胞培养中Wnt和TGF-β途径的激活前/后胰腺。一,b条,c（c）Wnt靶基因的mRNA表达(一)、Tgfb1、Tgfbr2(b条)和机器人1(c（c）)用RT-qPCR分析D8原代胰腺Pdx1培养物Cre公司和机器人2前/后动物。所有qPCR数据均参考家政基因Hprt。d日D8培养物中磷酸-Smad2的Western blot（WB）分析和使用ImageJ量化WB带密度。e（电子）D8 Robo2中由Vim识别的间充质细胞的代表性图像前/后Axin2、Tgfb1、Robo1或phospho-Smad2的免疫荧光/RISH染色培养物。免疫荧光图像中的细胞核用DAPI染色。图像是三到四个独立实验的代表。比例尺对应20 微米。所有数据均表示为平均值 + /− 扫描电镜；N个 = 4-6.使用unparied进行统计分析t吨用韦尔奇修正进行测试*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图4
图4
Robo2中肌成纤维细胞的激活前/后细胞培养依赖于TGF-β。一——c（c）上皮mRNA表达(一)和间充质(b条)标记物与TGF-β途径基因(c（c）)在D8原代胰腺培养物中，用galuniserib或DMSO载体处理。所有数据均指Hprt，并以平均值表示 + /− 扫描电镜，N个 = 5.使用unparied进行统计分析t吨用韦尔奇修正进行测试*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.d日用上皮标记物E-cad和间充质标记物Vim和/或αSma对Galunsertib或DMSO载体处理的D8胰腺培养物中Robo1进行免疫荧光染色和RISH。用DAPI对细胞核进行染色，并使用40倍放大率获得共焦图像。图像代表三到五个独立的实验。比例尺对应50 微米。e（电子）定量激活的肌成纤维细胞百分比（αSma+; 维姆+)总计Vim+D8原代胰腺培养物中的间充质细胞，用Galunisterib或DMSO载体处理。（f）通过RISH对D8原代胰腺培养物中每个间充质细胞的Robo1 mRNA进行定量，用Galunisterib或DMSO载体处理。以平均值表示的数据 + /− 扫描电镜；数据来自N个 ≥ 每组3只小鼠。使用unparied进行统计分析t吨用威尔士语的纠正进行测试***P（P） < 0.001
图5
图5
Robo2胰腺炎期间基质细胞和免疫细胞的激活前/后老鼠。一Pdx1诱导急性胰腺炎（AP）Cre公司和机器人2前/后在开始治疗后的第3天（D3）和第8天（D8），对连续2天腹腔注射蓝绿色素的动物和胰腺进行分析。AP的D3和D8胰腺切片的血红素和曙红（H&E）染色。比例尺对应50 微米。图像是五到六个独立实验的代表。b条——e（电子）上皮mRNA表达(b条)，间充质(c（c）)，TGF-β途径基因(d日)和免疫(e（电子）)Pdx1中D3 AP处的标记Cre公司和机器人2前/后动物。所有qPCR数据均参考家政基因Hprt。以平均值表示的数据 + /− 扫描电镜；N个 = 4-6.使用unparied进行统计分析t吨用韦尔奇的修正进行测试*P（P） < 0.05.（f）Pdx1全胰腺免疫标记基因表达的火山图Cre公司和机器人2前/后使用RT2 Profiler PCR阵列小鼠癌症炎症和免疫串扰（Qiagen）对D3AP的动物进行分析。克Pdx1之间差异表达的基因列表Cre公司和机器人2前/后D3 AP时的动物（折叠变化 > 1.5和第页 < 0.05).小时AP第8天胰腺切片产生的二次谐波（SHG）信号（紫色）的代表性最大投影。胰腺组织的自体荧光以绿色表示。比例尺对应50 微米。我量化二次谐波（SHG）信号强度以确定胶原交联。以平均值表示的数据 + /− 扫描电镜；N个 = 4-6.使用单向方差分析和土耳其的多重比较检验进行统计分析**P（P） < 0.01
图6
图6
TGF-β抑制抑制肌成纤维细胞活化和T细胞浸润。Caerulein治疗的动物同时接受TGF-β抑制剂galunisertib或盐水对照口服灌胃。一D3AP胰腺切片中磷酸-Smad2的免疫组织化学染色。细胞核用苏木精复染。图像是五个独立实验的代表。比例尺对应100 微米。b条D3AP胰腺切片中肌成纤维细胞标记物αSma和外分泌标记物淀粉酶的免疫荧光。图像是五个独立实验的代表。细胞核用DAPI染色。比例尺对应50 微米。c（c）D3AP胰腺切片中T细胞标记物CD3的免疫组织化学染色。图像是五个独立实验的代表。细胞核用苏木精复染。比例尺对应50 微米。d日磷酸-Smad2的手动定量+单元格/字段。e（电子）αSma的量化+区域/字段，使用ImageJ。（f）CD3的量化+区域/字段，使用ImageJ。所有图像均使用20倍放大率采集。以平均值表示的数据 + /− 扫描电镜；N个 ≥ 5；使用未配对的t吨用韦尔奇的修正进行测试*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图7
图7
ROBO1决定了ROBO2阴性PDAC患者的预后。一APGI队列PDAC样本中ROBO1和ROBO2免疫组织化学（IHC）的代表性图像。使用Aperio ImageScope软件以20倍的放大率采集图像 × . 比例尺对应50 微米。虚线表示组织学分区（肿瘤上皮、Epi、间充质细胞、Me）。b条APGI患者队列中ROBO1和ROBO2 IHC评分的图形表示(n个 = 109).c（c）APGI队列中ROBO1和2的RNA表达变化，通过RNAseq分析并表示为FPKM（Bailey等人之前发布的RNAseque数据）（方框的中心线对应于平均值，胡须是上限和下限）。d日使用QPure分析ROBO1 RNA表达（FPKM）和肿瘤细胞数之间的反向相关性。e（电子）如Moffitt等人所述，ROBO1 RNA表达（Biankin等人之前发表的微阵列基因表达分析）与正常和活化基质标记物之间的相关性。（f）免疫组织化学分析ROBO1和ROBO2联合蛋白表达的Kaplan–Meier生存曲线及log-rank统计检验(n个 = 90).克通过RNAseq分析ROBO1和ROBO2的联合RNA表达的Kaplan-Meier生存曲线和log-rank统计检验(n个 = 74)
图8
图8
ROBO2是胰腺中的基质抑制基因，通过TGF-β发挥作用。本研究主要发现的示意图。损伤后，无论是通过细胞培养还是急性胰腺炎诱导，胰腺上皮细胞中Robo2的缺失都会导致胰腺肌成纤维细胞的非自主激活和T细胞浸润的增加，这取决于TGF-β信号通路的激活
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