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.2018年11月30日；9(1):5121.
doi:10.1038/s41467-018-07481-7。

α-catenin肌动蛋白结合域的力依赖性别构关系控制粘附连接动力学和功能

石山信郎 1, Ritu Sarpal公司 2, 梅根·N·伍德 三, 萨曼莎·巴里克 4, 西川Tadateru 5, Hanako Hayashi先生 6, 安娜·B·科布 7, 安妮特·弗洛扎克 三, 亚历克斯·耶梅利亚诺夫 三, 罗德里戈·费尔南德斯·冈萨雷斯 2 7, Shigenobu Yonemura公司 6 8, 黛博拉·勒克班德 4 9, 卡拉·戈塔迪 三 10, 乌尔里希·特帕斯 2, Mitsuhiko Ikura公司 11 12
附属公司

α-catenin肌动蛋白结合域的力依赖性别构关系控制粘附连接动力学和功能

石山信郎等。 国家公社. .

摘要

α-catenin是一个关键的机械感受器，它与F-actin形成力依赖性相互作用，从而将钙粘蛋白-钙调素复合体耦合到粘附连接处的肌动蛋白细胞骨架（AJ）。然而，α-连环蛋白在张力下与F-肌动蛋白结合的分子机制尚不清楚。这里我们证明了α-catenin肌动蛋白结合域（αcat-ABD）的α1-螺旋是一个调节张力依赖性F-actin结合和捆绑的机械张力基序。含有α1-螺旋去折叠突变（H1）的αcat-ABD在体外与F-actin的结合增强。尽管全长α-连环蛋白H1可以产生抵抗机械破坏的上皮单层，但它不能在体内支持正常的AJ调节。结构和模拟分析表明，α1-螺旋变构控制肌动蛋白结合残基V796的动力学。αcat-ABD-H1同源二聚体的晶体结构表明，α-catenin可以促进肌动蛋白的捆绑，而它仍然与E-cadherin结合。我们认为，在组织形态发生过程中，αcat-ABT的强制依赖变构调节促进了与参与肌动蛋白捆绑、cadherin聚集和AJ重塑的F-actin的动态相互作用。

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数字

图1
图1
强制诱导的α1-螺旋去折叠增强了αcat-ABD的F-actin结合活性。一瞬时表达ABD（残基663-906）或ABD*（残基697-906）的R2/7细胞。αcat-ABD/ABD*-FLAG和肌动蛋白分别用抗DDDDK抗体和卵磷脂标记。比例尺，10 微米。b条αN-catenin、αE-catenin和vinculin的ABD晶体结构的比较。αcat-ABD包含三个不同的结构基序：α1-螺旋（α1；红圈）、β-发夹（βH；品红色圈）和C末端尾部（CT；黑圈）。PDB ID代码显示在括号中。c（c）α-catenin和vinculin一级序列的多序列比对。α1-螺旋和βH序列在α-catenin的三个同源序列（E、N和T；H、人类；m、小鼠）以及果蝇属α-连环蛋白（dα-catenin）。表明H1突变（RAIM670-673GSGS）。α-连环蛋白中三个肌动蛋白结合位点残基的保守性，以及长春花蛋白肌动蛋白结合位点残基I997和V1001，用紫色圆点标记。d日恒力SMD模拟期间选定时间点的αNcat-ABD结构快照（120的100-pN拉力 ns）（补充电影1）。卡通表示显示α1-螺旋（蓝色）在~60开始展开 纳秒。e（电子）α1-螺旋和V796的特写N个在αNcat-ABD晶体结构中。在恒定强制SMD仿真期间，V796N个以隐秘状态暴露（V796N个*; 洋红）45 ns，在60时α1展开前不久 纳秒(d日). 两个保守的α1-螺旋残基，R670N个和M673N个，与ABD的五螺旋束进行关键的相互作用，以减弱ABD-F-actin相互作用。（f）肌动蛋白共沉积分析比较了αEcat-ABD和αNcat-ABD的WT、H1和Δα1变体。虽然αE-catenin和αN-catenin中不到一半的总ABD-WT（0.37-0.45）与F-actin共沉积，但通过H1突变的缺失或去折叠，α1-螺旋的改变显著增加了与F-actim共沉积的突变αcat-ABD蛋白的数量（0.71-0.81）。上清液（S）和颗粒（P）组分显示。数据以平均值表示 ± 平均值标准误差（SEM）(N个 = 3). 方差分析显著性：***P（P） < 0.001
图2
图2
αNcat-ABD-H1的晶体结构揭示了一种新的ABD二聚体界面。一形式A的αNcat-ABD-H1二聚体的晶体结构（两个原聚体显示为蓝色和绿色）。ABD的N端和C端分别用蓝色和红色球体表示。三个肌动蛋白结合位点残基，L785N个，1792年N个和V796N个，显示为浅蓝色、粉红色和橙色球体。b条ABD二聚体界面的特写视图。中的虚线框一逆时针旋转约90°。一个原聚体的βH基序覆盖了由α1-螺旋在相邻原聚体中展开而暴露的疏水斑块（αNcat-ABD-WT的α1-螺旋以红色显示）。c（c）αNcat-ABD-H1的浓度依赖性CSP定位于βH残基。CSP大于8的残留物 Hz在αNcat-ABD-H1结构上以红色表示。d日αEcat-ABD的SEC-MALS分析。αEcat ABD WT（蓝色）和αEcat ABD-H1（橙色）的积分二聚体峰面积与αEcat ABD浓度的关系图。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(N个 = 3). 方差分析显著性：*P（P） < 0.05.e（电子）αEcat-ABD变异体、WT、H1、ΔβH和H1ΔβH的体外肌动蛋白共沉积分析。肌动蛋白捆绑通过低RCF（10000×克). F-肌动蛋白结合的ABD在高RCF（100000×克).（f）未标记F-actin和15N个/2H标记的αNcat-ABD-WT。在预饱和和未预饱和情况下观察到的主链酰胺信号强度的还原比率图。信号减少>60%和>35%的残留物显示在αNcat-ABD-WT结构上（右）。受影响的残基大多位于最后四个α螺旋（α3-α6）中
图3
图3
α1-螺旋和βH对多细胞结构的形成和伤口愈合至关重要。一表达α-catenin变体的R2/7细胞的上皮片破坏试验。显示了机械应力处理前后具有代表性的αEcat单层。b条图中显示了机械应力处理后的总细胞单层碎片。机械破坏导致αEcatFL细胞单层破裂，而αEcat-H1单层保持完整，只有少量碎片在低钙浓度下形成。数据以平均值表示 ± 标准偏差（SD）(N个 = 3). 方差分析显著性****P（P） < 0.0001.c（c）伤口前部表达αEcat变体的R2/7细胞的共焦图像。显示了插入框的特写视图。比例尺，20 微米。d日用表达αEcat-WT或αEcat-H1的R2/7细胞进行划痕伤口愈合试验。15小时后伤口愈合的区域显示为红色。比例尺 = 50微米。e（电子）显示总伤口闭合面积和伤口闭合百分比随时间变化的图。数据以平均值表示 ± SD（>35个视野（FOV）； > 5个生物复制品（BR））。方差分析显著性****P（P） < 0.0001.（f）图中显示了与αEcatFL细胞相比，伤口前部αEcat突变细胞的持续性而非速度的变化。数据以平均值表示 ± SD（>35视野； > 5 BR）。方差分析显著性**P（P） < 0.01
图4
图4
αCat ABD突变体未能拯救αCat功能果蝇属.一αCat ABD突变体过度表达的表型后果和表达于α类别−/−合子无效突变体。过度表达：所有突变结构均显示生存率显著降低(P（P） < 0.0001）与αCatFL过度表达相比。救援实验：突变体构建物显示出显著的救援作用（αCatFL、αCat-H1、αCat-Δα1、αCat-H1ΔβH[P（P） < 0.0001]）或增强（αCat-3A[P（P） < 0.0001]，α类别-ΔABD[P（P） = 0.0071]）α类别−/−合子突变表型。αCat-ΔβH的表达并没有显著改变α猫−/−突变表型。数据以平均值表示 ± 标准偏差。b条野生型胚胎的表皮α类别−/−头部形态发生失败的突变体（“头部开放”；箭头）α类别−/−表达αCat-H1的突变体，显示有缺陷的头部骨骼（“异常头部”；箭头），以及α类别−/−表达αCat-3A的突变体，除头部开放外，还显示背部洞（箭头）。c（c）HA标记的αCat变异体用实际5c-Gal4 da-Gal4在…的表皮果蝇属胚胎突变体α-类别(α类别−/−)第15阶段。以β-catenin标记的AJs。d日表皮伤口α类别−/−,α类别−/−表达αCatFL的突变体，以及α类别−/−表达αCat-H1的突变体。用GFP:：UtrophinABD标记F-actin。顶部面板显示最大伤口面积的时间（黄色线条勾勒伤口），底部面板显示表皮30 受伤后分钟。左前，背向上。比例尺，10 微米。e（电子）伤口面积随时间变化（左）和伤口闭合率（右）α类别−/−（红色，n个 = 12处伤口），α类别−/−表达αCatFL（青色，n个 = 10处伤口），以及α类别−/−表达αCat-H1（绿色，n个 = 10处伤口）。αCatFL，α类别−/−胚胎修复表皮损伤的速度明显快于α类别−/−胚胎(P（P） = 0.027），而αCat-H1α类别−/−胚胎与α类别−/−胚胎。方框图显示平均值（灰线）、SEM（方框）和SD（黑线）
图5
图5
α-catenin中关键肌动蛋白结合位点残基的鉴定。一基于vin-ABD/F-actin低温-EM结构（PDB ID:3JBI），αcat-ABD（红色）与F-actin内两个轴向相邻的肌动蛋白单体（深蓝和浅蓝）结合的模型。b条比较αEcat-ABD-WT（红色）和αNcat-ABD-XT（蓝色）的高分辨率晶体结构。αEcat-ABD-WT的整体结构与αNcat-ABD-XT非常相似，因为两个ABD结构可以与0.53的RMSD重叠 超过156个残余物。特写镜头（右图）显示，αEcat-ABD-WT包含一个空腔（粉红色分子包膜），该空腔可以在类似V796的隐秘状态下容纳V796N个在αNcat-ABD-WT结构中。c（c）αEcat-ABD变异体的肌动蛋白共沉淀分析：WT、L785A、I792A、V796A、3A、V714A、H1、H1L785A、H1I 792A和H1V 796A。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(N个 = 3). 方差分析显著性：**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001
图6
图6
α1-螺旋的展开影响V796的构象动力学。一用于αEcat ABD和F-肌动蛋白之间直接相互作用的动力学分析的BLI实验方案。带有LAbio肽的链霉亲和素涂层光学传感器通过高亲和力固定F-actin，从而限制附着的F-actin的运动，以最小化αcat-ABD诱导的肌动蛋白捆绑的发生。b条αEcat-ABD-WT的BLI响应曲线D类通过将浓度依赖的F-actin结合曲线（蓝色）拟合到2:1非均相结合模型（红色曲线）来获得这些值。c（c）αEcat-ABD-H1的BLI响应曲线。K系列D类该值是通过将浓度依赖的F-actin结合曲线（蓝色）拟合到1:1结合模型（红色曲线）得到的。d日基于NMR CS数据和以αNcat-ABD-WT晶体结构为模板的αNcat-ABD-WT和αNcat-ABD-H1的CS-Rosetta-CM模型。e（电子）在αEcat-ABD-WT（蓝色）、αNcat-ABD-XT（绿色）和αNcat_ABD-H1（洋红色）的平衡MD模拟期间，V796的构象状态。显示了在指定时间点包含V796的α5螺旋区域的快照。（f）平衡MD模拟期间V796和I792的β-碳原子之间距离的演变。虚线表示V796处于隐秘和暴露位置时的近似残留距离
图7
图7
钙粘蛋白-肌动蛋白复合物的动态重塑。α-catenin-dependent cadherin-actin linking，cadherin clustering and F-actin bundling的模型参与调节钙粘蛋白介导的细胞-细胞粘附促进新生和稳定连接。与钙粘蛋白-β-连环蛋白复合物结合的α-连环素的ABD与折叠的α1-螺旋和隐匿的V796处于衰减状态，与F-actin（I）形成弱相互作用。从β-连环蛋白中分离出来的α-连环素可以作为单体和N-末端连接的同二聚体（N-二聚体）存在。当钙粘蛋白-肌动蛋白复合物遇到用力的F-actin时（事实 + F类)αcat-ABD将V796暴露在表面，而α1-螺旋展开，与F-actin（II）形成捕获键。力通过α-catenin传播以展开M我该地区有助于向AJ招募vinculin（Vin）。强烈的F-肌动蛋白结合促进ABD的协同结合。当α-连环蛋白在F-actin上聚集在一起时，两个ABD包被的肌动蛋白丝之间的ABD二聚体促进了肌动蛋白束和钙粘蛋白复合物在AJs（III）的侧向聚集
图8
图8
促进肌动蛋白捆绑的αcat-ABD同型二聚体的分子模型。基于vin-ABD/F-actin低温-EM结构的αcat-ABD/F-actin复合物模型表明，两个αcat-ABND分子离散地结合到不同的肌动蛋白丝上（例如，αcat-ABT通过α5螺旋与F-actin结合）可以通过晶体学鉴定的ABD-二聚体界面进行同二聚体化，而不会与肌动蛋白丝产生任何空间位阻。我们认为α-catenin的ABD依赖性二聚化以反平行方式促进肌动蛋白捆绑（“+”和“-”分别表示倒刺端和尖端）。肌动蛋白丝的紧密间距（7~8 nm）与ABD*表达细胞形成的肌动蛋白棒内观察到的纤维间距离一致（补充图2c）
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