TGF-β induces corneal endothelial senescence via increase of mitochondrial reactive oxygen species in chronic corneal allograft failure

doi:10.18632/aging.101659

.2018年11月28日；10(11):3474-3485.

doi:10.18632/aging.101659。

慢性角膜移植失败时TGF-β通过增加线粒体活性氧诱导角膜内皮细胞衰老

李志远^1 2, 刘婷（Ting Liu）², 马俊伟¹, Qie Guo先生^三, 梁马⁴, 吕秋兰¹, 闫江¹, 赵伟², 张继生¹

附属公司

¹青岛大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科重点实验室，青岛，中国。
²山东省眼科重点实验室国家重点实验室培育基地，山东省眼病研究所，山东省医学科学院，青岛。
^三青岛大学附属医院临床药学部，青岛，中国。
⁴青岛大学附属医院儿童保健科，青岛，中国。

PMID： 30482886
预防性维修识别码：项目经理6286827
内政部： 10.18632/aging.101659

慢性角膜移植失败时TGF-β通过增加线粒体活性氧诱导角膜内皮细胞衰老

李志远等。老龄化（纽约州奥尔巴尼市）. 2018.

.2018年11月28日；10(11):3474-3485.

doi:10.18632/页.101659。

作者

李志远^1 2, 刘婷（Ting Liu）², 马俊伟¹, Qie Guo先生^三, 梁马⁴, 吕秋兰¹, 闫江¹, 赵伟², 张继生¹

附属公司

¹青岛大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科重点实验室，青岛，中国。
²山东省眼科重点实验室国家重点实验室培育基地，山东省眼病研究所，山东省医学科学院，青岛。
^三青岛大学附属医院临床药学部，青岛，中国。
⁴青岛大学附属医院儿童保健科，青岛，中国。

PMID： 30482886
预防性维修识别码：项目经理6286827
内政部： 10.18632/aging.101659

摘要

角膜内皮（CE）功能障碍会损害光学透明度，导致角膜移植失败。形态学上，CE细胞在角膜移植的晚期表现为过早衰老。然而，详细的分子机制在很大程度上尚不清楚。在这里，我们发现转化生长因子-β（TGF-β）在晚期移植失败的CE中升高。此外，衰老相关基因p21和p16也增加，这与TGF-β治疗后人类角膜内皮细胞B4G12的升高相一致。此外，TGF-β处理导致SA-β-gal的高阳性率，表明B4G12细胞发生细胞衰老。从机制上讲，我们证明TGF-β可以诱导线粒体ROS（mtROS）的产生，而mtROS清除剂可以挽救TGF-β处理后的CE细胞衰老。我们的研究提供了新的证据，证明TGF-β升高在慢性角膜移植失败的CE细胞衰老和丢失中起着关键作用，这可能是临床治疗的潜在靶点。

关键词：细胞衰老；慢性角膜移植失败；角膜内皮；线粒体活性氧；转化生长因子-β。

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利益冲突声明

利益冲突：作者声明没有利益冲突。

数字

图1
**慢性移植排斥患者角膜纽扣CE中衰老相关标志物和TGF-β1增加。**(A类)茜素红染色对慢性角膜内皮细胞衰竭的临床评价。(**B-C）**p16、p21的mRNA表达(B类)和TGF-β1(C类)在CE中有或没有慢性移植物衰竭(***P（P）*<0.01,**P（P）*<0.05). (**D-E公司**)代表性照片(D类)和组织病理学评分(E类)用于慢性衰竭CE中p16和TGF-β1的IHC染色。

图2
**TGF-β1诱导B4G12细胞衰老。**(**A-B公司**)TGF-β1诱导G1期阻滞。对照组和TGF-β1处理的B4G12细胞在48小时处理后进行细胞周期分析。DNA含量的代表性流式细胞术分析如（A）所示，数值为(B类). (**C-D公司**)在单独使用10 ng/ml TGF-β1或与NAC（10mM）联合治疗72小时的B4G12细胞中测量SA-β-Gal活性。单独使用NAC（10 mm）不会影响细胞周期状态和SA-β-Gal活性。条形图表示平均值±SD**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01. 所有实验均独立重复至少三次。

图3
**TGF-β1处理B4G12细胞导致p16和p21的诱导。**用10 ng/ml TGF-β1单独或与NAC（10mM）或NAA（10mM(A类)和蛋白质(**B-C公司**)TGF-β1诱导p16和p21的表达。NAC或NAA单独治疗（10mM）不会改变p16和p21的水平。条形图表示平均值±标准差**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01.

图4
**暴露于10ng/ml TGF-β1 48小时后，B4G12细胞产生mtROS。**(**A-B公司**)对照和TGF-β1处理的B4G12细胞在培养48小时后进行MitoSOX红色指示剂染色。mtROS的代表性流式细胞术分析如（A）所示，数值为平均值±SD（B）。(C类)用荧光显微镜对MitoSOX红和过氧橙1荧光进行成像。(D类)10 ng/ml TGF-β1处理后，检测CE细胞中SOD2蛋白的表达**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01. 所有实验都被独立地重复至少三次。

图5
**慢性衰竭小鼠CE的过早衰老和TGF-β1升高。**(**A-C公司**)同基因和慢性衰竭小鼠模型的角膜移植表型(**D-E公司**)第21页，第16页(D类)和TGF-β1(E类)在同基因和慢性失败组小鼠CE的转录水平上测量表达。(F类)慢性移植物衰竭CE中TGF-β1 IF染色的代表性照片***P（P）*<0.01,**P（P）*<0.05.

图6
**慢性移植物衰竭小鼠CE附近的白细胞。**(A类)H&E染色显示小鼠CE中的免疫细胞浸润。(B类)与同基因组相比，慢性衰竭组小鼠CE的RNA池中衰老相关分泌表型因子的表达**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01. 所有实验均独立重复至少三次。

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[1] Muraine M、Sanchez C、Watt L、Retout A、Brasseur G。穿透性角膜移植术的长期结果。一项10年以上的回顾性研究。Graefes Arch临床实验眼科。2003; 241:571–76. 2007年10月17日/00417-003-0691-z-DOI程序-公共医学

[2] Muraine M、Sanchez C、Watt L、Retout A、Brasseur G。穿透性角膜移植术的长期结果。一项10年以上的回顾性研究。Graefes Arch临床实验眼科。2003; 241:571–76. 2007年10月17日/00417-003-0691-z-DOI程序-公共医学

[3] Waldock A，Cook SD。角膜移植：我们有多成功？英国眼科杂志。2000; 84:813–15. 10.1136/bjo.84.8.813-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Waldock A，Cook SD。角膜移植：我们有多成功？英国眼科杂志。2000; 84:813–15. 10.1136/bjo.84.8.813-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

[5] 日本博纳诺。角膜内皮泵的分子机制。Exp-Eye Res.2012；95:2–7. 2016年10月10日/j.exer.2011.06.004-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

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