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.2018年11月27日；9(1):5006.
doi:10.1038/s41467-018-07344-1。

溶瘤疱疹病毒PTEN的表达指导T细胞介导的肿瘤清除

卢克·拉塞尔 1, 杰西卡·斯旺纳 2, 阿莱娜·克里斯蒂娜·杰梅·拉米雷斯 1, 王玉凤 三, 亚历克斯·斯普拉格 1, Yeshavanth Banasavadi-Siddegowda公司 1 2 4, 吉英佑 1 2, Gina M尺码更多 5, 罗利·克拉德尼 三, 张建英 6, 诺曼·L·雷曼 7, 迈克尔·奥斯特罗斯基 8, Bangxing Hong公司 2, 迈克尔·卡利吉乌里 9, 余建华 9, 巴尔文·考尔 10
附属公司

溶瘤疱疹病毒表达PTEN引导T细胞介导的肿瘤清除

卢克·拉塞尔等。 国家公社. .

摘要

工程溶瘤病毒在临床上被用来破坏癌细胞，并具有增强抗癌免疫的能力。10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物缺失在多种恶性肿瘤中普遍存在，并与免疫逃逸有关。染色体10α上缺失的N末端延伸亚型磷酸酶和张力蛋白同源物（PTENα）调节细胞功能，包括蛋白激酶B信号传导和线粒体三磷酸腺苷的产生。在这里，我们构建了HSV-P10，一种表达PTENα的复制型溶瘤疱疹病毒，并证明其抑制PI3K/AKT信号传导，增加细胞三磷酸腺苷分泌，减少感染肿瘤细胞中的程序性死亡-1表达，从而启动适应性免疫反应并克服肿瘤免疫逃逸。单剂量HSV-P10可使患有颅内肿瘤的小鼠长期存活，引发抗癌T细胞免疫，导致肿瘤排斥反应。这表明HSV-P10是一种抗癌治疗的溶瘤和免疫刺激疗法。

PubMed免责声明

利益冲突声明

B.K.是专利申请的发明人：WO2018023114A1，描述了HSV-P10。

数字

图1
图1
HSV-P10的构建和表征。一PTEN和PTENα编码序列的图示显示了PTENα起始密码子中的突变，以增强全长PTENα的翻译。b条–c（c）野生型F株HSV1主干DNA结构的图形表示，显示双缺失γ34.5基因和包含增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因的ICP6基因座，该基因座带有PTENα插入（HSV-P10）或没有PTENα（HSVQ）。d日随着时间的推移，受感染肿瘤细胞裂解物中PTENα的产生。所示肿瘤细胞在MOI感染HSV-P10 = 0.5，收获0-12 hpi和蛋白印迹法检测PTEN
图2
图2
HSV-P10 AKT抑制。一感染HSVQ（Q）或HSV-P10（P）或未经治疗（NV）的指示细胞裂解物的Western blots。感染细胞（MOI = 1） 被裂解24 hpi，并检测PTENα、pAKT（S473）、Akt和GAPDH的表达。L表示分子量阶梯。b条条件培养基中PTEN分泌表达的Western blot。从感染24的U87∆EGFR细胞中浓缩20X培养基 h与HSVQ（Q）或HSV-P10（P10）结合，并检测分泌的PTENα。L表示分子量阶梯。c（c）感染U87∆EGFR细胞15中pAkt-S473和病毒编码GFP的流式细胞术分析 马力。d日沿着一条穿过一个或两个细胞视场的随机线对荧光强度进行光谱分析，显示所示细胞的pAKT（红色）、DAPI（蓝色）和GFP（绿色）。年-轴表示任意荧光单位（AFU）。注意HSVQ感染（GFP阳性）细胞中pAKT的强度高于相邻未感染（GFP-阴性）细胞（中间面板）。注意HSV-P10感染（GFP阳性）细胞与相邻未感染（GFP-阴性）细胞相比pAKT强度缺乏增加（底部面板）
图3
图3
PTENα对HSV-P10感染细胞的影响。一HSV-P10感染细胞线粒体膜电位升高6 马力。种子细胞在MOI感染HSVQ或HSV-P10 = 0.5代表6 h、 用荧光显微镜观察JC-1红色荧光显示的线粒体膜电位。比例尺 = 100 微米。b条受感染细胞释放ATP 24 马力。显示的数据是感染细胞条件培养基中的平均ATP浓度24 高性能指数 ± S.D.使用双尾学生的T型-测试。(n个 = 3/组**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).c（c）感染细胞的细胞裂解液中测定的ATP 24 马力。所示数据为平均ATP浓度24 高性能指数 ± S.D.使用双尾学生的T型-测试。(n个 = 3/组**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).d日DB7细胞的Western blot 24 hpi伴HSVQ（Q）、HSV-P10（P）或未经治疗（NV） ± PI3Ki（LY294002）。L表示分子量阶梯。e（电子）DB7或MDA-468细胞的ATP释放12 hpi与HSVQ或HSV-P10。HSVQ和PI3Ki处理的样品也进行了ATP释放评估。显示的数据是感染细胞条件培养基中的平均ATP浓度 ± SEM。使用双尾学生的T型-测试(n个 = 6/组*第页 < 0.05时***第页 < 0.001，未另行规定。 = 不重要）
图4
图4
HSV-P10的动力学。一HSVQ和HSV-P10病毒在指定细胞中复制的比较。在指定的MOI感染种子肿瘤细胞，并监测24-48天GFP的表达 h使用Cytation 5细胞成像多模式读取器和BioSpa 8自动孵化器（BioTek Instruments，INC.）。GFP对象计数被量化并绘制成每个治疗组平均4个孔 ± SEM。黑线：无病毒，蓝线：HSVQ，红线：HSV-P10。b条低MOI下HSVQ（蓝线）与HSV-P10（红线）的细胞裂解活性。感染HSVQ或HSV-P10的肿瘤细胞系在MOI时的细胞活力 = 用MTT测定感染后指定时间点的所有细胞为0.0625。显示的数据是活细胞相对于未感染对照的百分比 ± S.D.公司(n个 = 6） 。c（c）HSVQ和HSV-P10病毒产量的比较（爆发大小）。所示数据为培养物的中位滴度 ± S.D.公司(n个 = 3/组）。d日高MOI下HSVQ（蓝线）与HSV-P10（红线）的细胞裂解活性。感染HSVQ或HSV-P10的肿瘤细胞系在MOI时的细胞活力 = MTT测定感染后指定时间点的所有细胞为0.5。显示的数据是活细胞相对于未感染对照的百分比 ± 标准偏差(n个 = 6)
图5
图5
HSV-P10的安全。HSVQ（蓝线）和HSV-P10（红线）在HUVEC培养物中的病毒传播(一)和U251T3肿瘤细胞(b条)使用Cytation 5实时成像系统进行评估，其中GFP的表达随时间变化进行监测。GFP对象计数被量化并绘制成每个治疗组平均4个孔 ± 扫描电镜。c（c）分化神经元的免疫荧光染色显示MAP2和Tuj1染色。比例尺 = 50 微米。d日神经元和MDA468细胞感染（GFP），随后进行GFP可视化。显示的数据是感染HSVQ或HSV-P10的指示细胞的直方图。e（电子）通过流式细胞术评估神经元中的细胞溶解活性（PI/Annexin-V）24 马力。受感染（GFP阳性）神经元和MDA-468细胞的膜联蛋白斑点和PI染色
图6
图6
HSV-P10可提高乳腺癌脑转移小鼠的总体生存率。一动物研究示意图。b条DB7荷脑肿瘤FVB/N小鼠经肿瘤内盐水对照治疗后的生存曲线（蓝线：n个 = 41），HSVQ（红线：n个 = 38）或HSV-P10（绿线：n个 = 38）肿瘤细胞植入后7天。通过Logrank（Mantel–Cox）试验评估存活率的显著性，每次试验仅比较两条存活曲线(**第页 < 0.01, ****第页 < 0.0001).c（c）图5b中用HSV-P10治疗的一只代表性长期存活小鼠的脑磁共振成像（MRI） > 肿瘤细胞植入后90天。白色箭头表示初始注射部位的针迹。d日HSV-P10治疗的长期存活小鼠的存活曲线（绿线：n个 = 5） 从图5b中可以看出，与年龄匹配的对照小鼠（蓝线：n个 = 8). 通过Logrank（Mantel–Cox）试验评估生存率的重要性(***第页 < 0.001).e（电子）图5d中一只代表性长期存活小鼠肿瘤复发后45天的脑部MRI。白色箭头表示重新注入位置的针迹
图7
图7
HSV-P10降低细胞表面PD-L1的表达。一流式细胞术测定的PD-L1表达直方图16 人类和小鼠肿瘤细胞系中的hpi。盖茨被放置在活细胞上，然后是GFP阳性细胞。根据PD-L1染色计算相对荧光强度。红色直方图：同型对照，蓝色直方图，无病毒，橙色直方图为HSVQ，绿色直方图是HSV-P10。b条用无病毒、HSVQ或HSV-P10处理并用PDL-1抗体染色的指示细胞的相对中值荧光强度（RFI）的量化，其中统计学意义通过单向方差分析进行评估(n个 = 3/组*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001, ****第页 < 0.0001).c（c）PD-L1表达的变化( ± 在低MOI感染HSVQ或HSV-P10的未感染（GFP阴性）DB7细胞上，通过单向方差分析评估统计显著性(n个 = 3, *第页 < 0.05时****第页 < 0.0001). 将闸门放置在活细胞上，然后放置在GFP阴性细胞上。根据PD-L1染色计算相对荧光强度。d日流式细胞术测定PD-L1表达的变化12 HSVQ治疗感染DB7细胞的hpi ± PI3Ki或HSV-P10（LY294002）。补充图5概述了选通电路图
图8
图8
HSV-P10诱导免疫细胞向感染肿瘤内流增强。荷瘤FVB/N小鼠在肿瘤植入后8天接受1e5 pfu HSVQ、HSV-P10或生理盐水对照治疗。一注射病毒后3天，缝合小鼠大脑H&E染色矢状截面的4X亮场图像。b条病毒注射后3天小鼠脑矢状切面上H&E、角蛋白8、F4/80、NKp46、CD3、CD8α、PD-L1和HSV1（GFP）的代表性20X亮场图像。比例 = 0.1 毫米。c（c）巨噬细胞比率（CD11b + 80层/四层 + CD45型明亮的)小胶质细胞（CD11b + 80层/四层 + CD45型昏暗的).d日MHC-II阳性细胞百分比。e（电子）树突状细胞（CD11c + CD80型 + MHC-II型 + ) 渗透。（f）NK细胞（CD49b + NKp46号 + ) 渗透。克CD8（CD8） + T细胞（CD3 + CD4细胞 + ) 渗透。小时CD4细胞 + T细胞（CD3 + CD8（CD8） + ) 渗透。所示数据为平均值 ± s.d公司(n个 = 3/组）通过单向ANAOVA评估统计显著性(n个 = 3, *第页 < 0.05, ***第页 < 0.001, ****第页 < 0.0001). 选通策略(c（c）–小时)如补充图6所示
图9
图9
T细胞免疫在病毒介导的肿瘤清除中的作用。一T细胞耗竭研究示意图。b条通过IP抗CD4、抗CD8或同种治疗确认T细胞耗竭24 收割前h。分离脾细胞24 IP给幼年FVB/N小鼠注射抗T细胞耗竭抗体后h，并检测CD3 + , CD4细胞 + , 和CD8 + 流式细胞术测定的T细胞。使用正向和侧向散射对活细胞进行门控，然后在CD4-FITC和CD8-PE上进行门控。单色阳性象限（Q1代表CD8 + CD4和Q3 + ) 被审问以确定损耗。c（c）肿瘤细胞植入后7天用生理盐水对照或HSV-P10治疗的DB7荷瘤FVB/N小鼠的存活率，以及病毒注射后2、4和7天的同种或抗CD4抗体。通过Logrank（Mantel–Cox）试验评估生存率的重要性(n个 = 10, **第页 < 0.01).d日肿瘤细胞植入后7天用生理盐水对照或HSV-P10治疗的DB7荷瘤FVB/N小鼠的存活率，以及病毒注射后2、4和7天的同种或抗CD8抗体的存活率。通过Logrank（Mantel–Cox）试验评估生存率的重要性(n个 = 10, **第页 < 0.01).e（电子） 51与CD3共培养的未感染DB7肿瘤细胞的Cr释放 + 图5d中未经治疗的幼年小鼠或免疫小鼠的脾细胞。所示数据为平均值 ± s.d.统计显著性由单尾Student’sT型-测试(n个 = 3中*第页 < 0.05)
图10
图10
HSV-P10抗肿瘤活性示意图：HSVQ（蓝色）感染（底部细胞）激活AKT/mTOR信号，启动细胞表面PDL-1的诱导，为肿瘤微环境中的免疫细胞提供免疫抑制信号。感染HSV-P10（红色）后，受感染细胞中PTENα的表达降低了磷脂酰肌醇三磷酸和磷脂酰肌糖醇二磷酸的比率（PIP3/PIP2），从而负调控AKT/mTOR通路。PTENα也位于线粒体，导致感染HSV-P10的肿瘤细胞释放更多ATP，从而激活强大的抗肿瘤免疫反应。活化的巨噬细胞、中性粒细胞和CD8的浸润增加 + T细胞导致更有效的肿瘤细胞溶解，并转化为更好的治疗效果
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