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.2018年11月26日；9(12):1160.
doi:10.1038/s41419-018-1185-6。

IL-4依赖性Jagged1表达/处理与慢性淋巴细胞白血病细胞的存活相关，但与Notch活化无关

菲洛梅娜·德·法尔科 1, 比阿特丽斯·德尔·帕帕 1, 斯特凡诺·巴多尼 2, 丽塔·萨巴蒂尼 1, 弗朗卡·法尔泽蒂 1, 毛罗·迪安尼 三 4, 玛丽亚·保拉·马泰利 1, 费德里卡·梅萨索马 1, 玛丽亚·佩卢洛 5, 马可尼 6, 保罗·斯波托莱蒂 7, 伊莎贝拉·斯克雷帕蒂 8, 伊曼纽拉·罗萨蒂 9
附属公司

IL-4依赖性Jagged1表达/处理与慢性淋巴细胞白血病细胞的存活相关，但与Notch活化无关

菲洛梅娜·德·法尔科等。 细胞死亡病. .

摘要

正如先前报道的那样，慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞表现出组成型Notch1/2激活，并表达Notch配体Jagged1。尽管人们越来越了解Notch改变对CLL生物学和发病机制的影响，但在CLL细胞中表达的Jagged1的作用仍不明确。在其他类型的细胞中，研究表明，在Notch结合后，Jagged1不仅激活信号接收细胞中的Notch，而且在信号发送细胞中进行蛋白水解激活，触发具有生物效应的信号。我们研究了在CLL细胞中表达的Jagged1是否经历了蛋白水解过程和/或能够通过自分泌/旁分泌环诱导Notch激活，重点研究了CLL前生存因子IL-4对这些细胞中Notch-Jagged2系统的作用。我们发现Jagged1在CLL细胞中进行了组成性加工，生成了一个胞内片段，该片段移位到细胞核中，胞外片段释放到培养上清液中。IL-4增强了Jagged1及其细胞内片段的表达，以及Notch1/2的激活。IL-4诱导的Notch1/2激活增加与相应上调的Jagged1水平无关。事实上，用Jagged1中和抗体阻断CLL细胞之间的Notch-Jagged2相互作用并不影响Notch靶Hes1的表达。值得注意的是，抗Jagged1抗体部分阻止了IL-4诱导的Jagged1processing和细胞存活率的增加，这表明Jagged1,1处理是IL-4诱导CLL细胞存活的事件之一。与此一致，小干扰RNA沉默Jagged1部分抵消了IL-4促进CLL细胞存活的能力。研究IL-4促进不依赖Jagged1的CLL细胞Notch1/2活化的途径，我们发现PI3Kδ/AKT和PKCδ分别参与上调Notch1和Notch2蛋白。总的来说，本研究为CLL细胞中的Notch-ligand系统提供了新的见解，并建议以该系统为靶点可能被开发为CLL的一种新的/额外的治疗方法。

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利益冲突声明

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数字

图1
图1。Jag1在CLL细胞中构成性加工。
一–c（c）25例患者进行了Jag1的Western blot分析 微克原代CLL细胞的全细胞裂解物（WCL）(n个 = 21）、MEC1细胞系和来自健康供体的PBL(n个 = 3） 使用三种不同的C末端抗体（Abs），如印迹顶部所示。面板中的数据一使用面板中的Jag1 C-20 Ab.数据获得b条和c（c）来自代表性CLL样品，其中使用Jag1 TS1.15H重复分析Jag1(b条)和Jag1 E-12(c（c）)绝对值。从IM9细胞株分离的WCL作为Jag1表达的阳性对照。用抗GAPDH抗体重新标记印迹，评估蛋白质负载量。在每个印迹中，显示了分离的面板，因为检测Jag1-FL和Jag1碎片需要不同的X射线胶片曝光。分子量标记（kDa）的位置显示在印迹的右侧。在带有PBL的污渍中，在PBL2和CLL11之间放置了一条空车道，以避免交叉污染。垂直线插入面板中间螺栓b条表示重新定位的凝胶通道。所有斑点的完整图像如补充图S1所示
图2
图2。Jag1处理产生一个释放到CLL培养基的细胞外片段和一个易位到细胞核的细胞内片段。
一在可溶性蛋白（40 µg）从CLL细胞收集的条件培养基（CM）(n个 = 10; CLL4-13，选择包括具有不同临床和生物学特征的患者），以及在无血清条件下培养指定时间的MEC1细胞系。使用在与CLL和MEC1培养物相同的条件下孵育但不含白血病细胞的无血清培养基（表示为培养基）作为阴性对照。使用来自各CLL样本和MEC1细胞系的WCL作为Jag1-FL分子量的对照。Ponceau红染色可评估蛋白质负载。显示了典型的CLL案例。斑点的完整图像如补充图S2A所示。b条使用C末端Jag1 C-20抗体对25例患者进行了Jag1的Western blot分析 μg CLL核（NE）和细胞质（Cyt）提取物(n个 = 10; CLL4-13）和MEC1细胞。使用抗层粘连蛋白B1和抗β-微管蛋白抗体评估适当的分馏和蛋白质负荷。来自各CLL样本和MEC1细胞的WCL用作Jag1-TM和Jag1-IC分子量的对照。WCL、NE和Cyt车道之间设置了一条空车道，以避免潜在的交叉污染。显示了典型的CLL案例。斑点的完整图像如补充图S2B所示。c（c）代表性CLL样品和MEC1细胞中Jag1 IC亚细胞定位的共聚焦显微镜图像。CLL细胞(n个 = 5；CLL7-11）和MEC1细胞用C端Jag1 HPA021555抗体（绿色）染色，细胞核用DAPI染色（蓝色），如“材料和方法”所述，然后用共焦显微镜进行分析。上面的图像显示一个代表性字段，下面的图像显示字段中代表性CLL或MEC1单元格的z堆栈中的一个切片。每个图像中都显示了比例尺
图3
图3。慢性淋巴细胞白血病患者Jag1表达水平与临床状态的相关性分析。
一–d日根据预后因素比较CLL亚组患者中Jag1-FL表达水平。以Jag1-FL/GAPDH比值计算并以密度单位（U）表示的Jag1-FL的表达水平在IGVH（IGVH）突变状态(一)，ZAP70表达(b条)，CD38表达(c（c）)和细胞遗传学亚群(d日). 采用Mann-Whitney检验进行统计分析；纳秒：不重要。e（电子）根据Jag1-FL表达水平，CLL患者总生存率（OS）的Kaplan-Meier曲线。CLL患者分为两个亚组：一个亚组(n个 = 11） 定义为Jag1你好Jag1-FL/GAPDH比率 ≥ 0.53; 另一个子组(n个 = 10） 定义为Jag1低的Jag1-FL/GAPDH比率 < 0.53. 使用对数秩检验比较生存曲线。差异不显著
图4
图4。IL-4增强CLL细胞中Jag1的表达。
一–（f）CLL细胞培养24小时 h带或不带25 纳克/毫升IL-4(n个 = 6; CLL7-12，选择包括具有不同临床和生物学特征的患者）。一,b条使用C末端Jag1 C-20抗体对25例患者进行了Jag1的Western blot分析 用抗GAPDH抗体重制印迹，评估微克全细胞裂解物和蛋白质负载。一在每个印迹中，显示了分离的面板，因为检测Jag1 FL和Jag1片段需要不同的X射线胶片曝光。显示了典型案例。斑点的完整图像如补充图S4A所示。b条通过密度分析评估Jag1-FL、Jag1-TM和Jag1-IC对应的谱带密度，并计算相对于GAPDH的密度单位（U）。数据是平均值 ± 6名患者的SD。**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001根据学生的t吨测试。c（c）,d日使用C末端Jag1 C-20抗体对25例患者进行Jag1-IC蛋白印迹 μg核提取物。使用抗层粘连蛋白B1和抗β-微管蛋白抗体评估蛋白质载量和适当分馏。c（c）显示了典型案例。裁剪过的斑点的完整图像如补充图S4B所示。d日对每个样品的斑点进行密度分析，并计算相对于层粘连B1的密度单位（U）。数据是平均值 ± 6名患者的SD。***P（P） < 0.001，根据学生的t吨测试。e（电子）通过实时定量PCR评估Jag1的mRNA水平，并将其归一化为GAPDH，表示为相对于未处理细胞的折叠变化。结果是平均值 ± 6名患者的SD。*P（P） < 0.05根据学生的t吨测试。（f）通过Annexin V/PI（An V/PI）染色的流式细胞术分析评估细胞活力和凋亡。结果以活菌百分比（An V−/圆周率−)单元格和是平均值 ± 6名患者的SD。***P（P） < 0.001根据学生的t吨测试
图5
图5。IL-4对CLL细胞中Jag1表达的影响由PI3Kδ/AKT信号介导。
一25例患者进行了AKT Ser473磷酸化（phospho-AKT）的Western blot分析 使用或不使用25培养的CLL细胞的µg全细胞裂解物 ng/ml IL-4用于指定时间。使用抗总AKT和抗GAPDH抗体评估蛋白质负荷。显示了一个典型案例。印迹的完整图像如补充图S5A所示。b条–e（电子）CLL细胞，预处理2 使用PI3Kδ抑制剂Idelalisib（5 μM）或0.01%二甲基亚砜作为对照，再培养24小时 h带或不带25 纳克/毫升IL-4(n个 = 6; CLL10和CLL12-16，选择包括具有不同临床和生物学特征的患者）。b条使用C末端Jag1 C-20抗体对25例患者进行了Jag1的Western blot分析 µg全细胞裂解物，并用抗GAPDH抗体重新标记印迹，评估蛋白质负载。显示了典型案例。斑点的完整图像如补充图S5B所示。c（c）对每个样品的斑点进行密度分析，并计算相对于GAPDH的密度单位（U）。数据是平均值 ± 6名患者的SD。纳秒：两组之间的差异不显著；**P（P） < 0.01根据学生的t吨测试。d日,e（电子）通过Annexin V/PI（An V/PI）染色的流式细胞术分析评估细胞活力和凋亡。d日结果显示为活菌百分比（An V−/圆周率−)，早期凋亡（An V+/圆周率−)，晚期凋亡（An V+/圆周率+)和坏死（An V−/圆周率+)单元格。显示了典型案例。e（电子）结果以存活百分比表示（An V−/圆周率−)单元格和是平均值 ± 6名患者的SD。*P（P） < 0.05,***P（P） < 0.001根据学生的t吨测试
图6
图6。IL-4增强CLL细胞中Notch1和Notch2的表达和激活。
一–c（c）CLL细胞培养24小时 h带或不带25 纳克/毫升IL-4(n个 = 6; CLL7-12，选择包括具有不同临床和生物学特征的患者）。一,b条25例患者进行了Notch1、Notch2和Hes1的Western blot分析 µg全细胞裂解物，并使用抗GAPDH抗体评估蛋白质负载。一显示了典型案例。斑点的完整图像如补充图S6A–C所示。b条通过密度分析评估对应于Notch1-TM、Notch1-IC、Notch2-TM、Notch2-IC和Hes1的带密度，并计算相对于GAPDH的密度单位（U）。数据是平均值 ± 6名患者的SD。纳秒：两组之间的差异不显著；*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01根据学生的t吨测试。c（c）通过实时PCR评估Notch1和Notch2 mRNA水平，将其归一化为GAPDH，并表示为相对于未处理细胞的折叠变化。结果是平均值 ± 6名患者的SD。IL-4的作用不显著
图7
图7。阻断CLL细胞之间的Notch–Jag1相互作用不会影响IL-4诱导的Notch激活，但会降低IL-4诱导的Jag1加工和细胞活力。
一–（f）CLL细胞培养48 h带或不带25 60μg/ml IL-4 µg/ml Jag1中和抗体或山羊IgG抗体作为同型对照（ctrl-Ab）(n个 = 5；CLL7-8和CLL10-12，选择包括具有不同临床和生物学特征的患者）。一–d日25例患者进行了Hes1和Jag1的Western blot分析 用抗GAPDH抗体重制印迹，评估微克全细胞裂解物和蛋白质负载。一,c（c）显示了典型案例。一Hes1斑点的完整图像如补充图S7A所示。c（c）对于Jag1分析，使用C-20抗体。在每个印迹中，显示了分离的面板，因为检测Jag1-FL和Jag1碎片需要不同的X射线胶片曝光。Jag1斑点的完整图像如补充图S7B所示。b条,d日通过密度计分析评估对应于Hes1、Jag1 FL、Jag1 TM和Jag1 IC的带的密度，并计算相对于GAPDH的密度计单位（U）。数据是平均值 ± 5名患者的SD。纳秒：两组之间的差异不显著；*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01根据学生的t吨测试。e（电子）,（f）通过Annexin V/PI（An V/PI）染色的流式细胞术分析评估细胞活力和凋亡。e（电子）结果显示为活菌百分比（An V−/圆周率−)，早期凋亡（An V+/圆周率−)，晚期凋亡（An V+/圆周率+)和坏死（An V−/圆周率+)单元格。显示了典型案例。（f）结果以活菌百分比（An V−/圆周率−)单元格和是平均值 ± 5名患者的SD。**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001，根据学生的t吨测试
图8
图8。Jag1沉默可抵消IL4依赖性的CLL细胞活力增加。
一–d日如“材料和方法”所述，用对照siRNA（siCtrl）和Jag1 siRNA（siJag1）转染CLL细胞，然后培养72小时 在含有25的完整培养基中培养h 纳克/毫升IL-4(n个 = 5；CLL7-8和CLL10-12）。一使用Jag1 C-20抗体对25例患者进行了Jag1的Western blot分析 用抗GAPDH抗体重制印迹，评估微克全细胞裂解物和蛋白质负载。显示了典型案例。在每个印迹中，显示了分离的面板，因为检测Jag1-FL和Jag1碎片需要不同的X射线胶片曝光。印迹的完整图像如补充图S8所示。b条通过密度分析评估Jag1-FL、Jag1-TM和Jag1-IC对应的谱带密度，并计算相对于GAPDH的密度单位（U）。数据是平均值 ± 5名患者的SD。*P（P） < 0.05根据学生的t吨测试。c（c）,d日通过Annexin V/PI（An V/PI）染色的流式细胞术分析评估细胞活力和凋亡。c（c）结果显示为活菌百分比（An V−/圆周率−)，早期凋亡（An V+/圆周率−)，晚期凋亡（An V+/圆周率+)和坏死（An V−/圆周率+)单元格。显示了典型案例。d日结果以活菌百分比（An V−/圆周率−)单元格和是平均值 ± 5名患者的SD。**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001，根据学生的t吨测试
图9
图9。IL-4诱导CLL细胞Notch1和Notch2上调的信号通路。
CLL细胞(n个 = 5；选择CLL7-8和CLL10-12，包括具有不同临床和生物学特征的患者）进行预培养2 h带5 µM Idelalisib或0.01%二甲基亚砜(一,b条)，或使用10 µM Rottlerin或0.05%二甲基亚砜(c（c）–（f）)，然后培养25个或不培养25个 ng/ml IL-4继续24小时 小时。a–d日25例患者进行了Notch1和Notch2的Western blot分析 µg全细胞裂解物，并使用抗GAPDH抗体评估蛋白质负载。一,c（c）显示了典型案例。斑点的完整图像如补充图S9A–C所示。b条,d日通过密度分析评估与Notch1-TM、Notch1-IC、Notch2-TM和Notch2-IC对应的谱带密度，并计算相对于GAPDH的密度单位（U）。数据是平均值 ± 5名患者的SD。纳秒：两组之间的差异不显著；*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001根据学生的t吨测试。e（电子）,（f）通过Annexin V/PI（An V/PI）染色的流式细胞术分析评估细胞活力和凋亡。e（电子）结果显示为活菌百分比（An V−/圆周率−)，早期凋亡（An V+/圆周率−)，晚期凋亡（An V+/圆周率+)和坏死（An V−/圆周率+)单元格。展示了具有代表性的案例。（f）结果以活菌百分比（An V−/圆周率−)单元格和是平均值 ± 5名患者的SD。*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001根据学生的t吨测试
图10
图10。前生存因子IL-4存在时CLL细胞中Jag1和Notch1/Notch2信号网络的示意图。
CLL细胞组成性表达Notch1/Notch2受体和Jag1配体。IL-4激活PI3Kδ/AKT信号以增加Jag1表达和Notch1激活，PKCδ信号以增加Notch2激活。Jag1和Notch1/Notch2之间的相互作用不会激活Notch信号，而是诱导Jag1处理，生成细胞内片段（Jag1-IC），该片段迁移到细胞核中，并通过尚待定义的机制促进CLL细胞存活（“？”）。即使是PI3Kδ/AKT和PKCδ以配体依赖的方式激活Notch信号的机制仍不清楚（“？”）。星号表示靶向CLL中Notch-ligand系统的潜在药物分子事件
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