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.2019年1月18日；294(3):1045-1058.
doi:10.1074/jbc。RA118.004471。 Epub 2018年11月26日。

帕金森病和多系统萎缩具有明显的α-突触核蛋白种子特征

Tritia R Yamasaki公司 1, 布兰登·霍姆斯 2, 詹妮弗·L·弗曼 2, Dhruva D Dhavale公司 2, 布莱恩特·W·苏 三, Eun-Suk宋 三, 奈杰尔·凯恩斯 2 4, 保罗·T·科茨鲍尔 2, 马克·戴蒙德 5
附属公司

帕金森病和多系统萎缩具有明显的α-突触核蛋白种子特征

Tritia R Yamasaki公司等。 生物化学杂志. .

摘要

帕金森氏病（PD）和多系统萎缩（MSA）是一种独特的临床综合征，其特征是神经元和胶质细胞中的α-突触核蛋白（α-syn）原纤维病理性积聚。这些疾病和其他神经退行性疾病可能通过朊蛋白样机制进展。朊病毒的传播模型预测存在连接病理聚集结构和神经病理学的“菌株”。朊病毒株是稳定繁殖的聚合构象体内导致具有明确潜伏期和神经病理学模式的疾病。事实上，τ朊病毒已经被明确定义，研究表明α-syn和β-淀粉样蛋白也可能形成菌株。然而，缺乏描述PD特征的研究-与MSA衍生的α-syn菌株或证明这些独特的构象在细胞或动物之间稳定繁殖。为了填补这一空白，我们使用了一种基于FRET的检测方法，该方法利用稳定表达α-syn（A53T）-CFP/YFP融合蛋白的HEK293T“生物传感器”细胞系检测PD和MSA患者脑提取物中的α-syn-种子。MSA提取物的可溶性和不溶性组分都具有较强的种子活性，而只有PD提取物的不溶性部分具有种子活性。MSA-seed包涵体的形态与PD-seed包涵体不同。这些差异持续存在于聚集到第二代生物传感器细胞的传播过程中。我们得出结论，PD和MSA具有非常独特的生物化学性质，可以在细胞系统中传递到α-syn单体。这些发现与PD和MSA的基础上存在不同的α-syn菌株的观点一致，并为同核蛋白病的诊断提供了可能的方向。

关键词：帕金森病；α-突触核蛋白；生物传感器；原纤维；荧光共振能量转移；多系统萎缩；神经变性；朊病毒株；蛋白质聚集。

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数字

图1。
图1。
基于FRET的检测α-syn种子活性的分析。 A、，利用α-syn（A53T）-CFP/YFP和（WT）-CFP/YFP生物传感器对瞬时转染细胞中的重组WT-synuclein原纤维进行接种反应，通过FRET试验测得接种活性产生的剂量-反应曲线。B、，重组α-合成纤维的剂量反应。将表达α-syn（A53T）-CFP/YFP生物传感器的稳定细胞暴露于含有脂多卡因的增加量的α-syn-原纤维中，并使用FRET流式细胞术定量诱导聚集。1 p时发生可检测的转换米纤维（单体当量）；*，第页< 0.007.C、，α-syn-CFP/YFP生物传感器细胞对α-syn具有特异性。10牛顿米α-合成纤维产生强劲的种子（**，第页<0.0001），但不是100 n米Aβ（1-42）或100 n米tau纤维。D、，诱导α-syn-CFP/YFP包裹体的荧光图像。图像放大倍数为×40，比例尺为25μm。箭头表示包含在生物传感器细胞内。E、，在FRET生物传感器测定中，在100 n时，脂多糖胺增强α-syn种子检测米重组α-合成纤维的浓度（*，第页< 0.001,t吨与车辆处理条件相比的试验）。
图2。
图2。
从PD和MSA脑的不溶性和可溶性部分接种α-Syn。 A、，种子实验中使用的PD、MSA和正常对照大脑的显微镜检查。比例尺=100微米。患者样本显示如下：PD#4 AC、PD#4 Am、MSA#4 Cb、MSA#14 BG、Control#2 AC、Am、Cb和BG。B、，从PD前扣带回和杏仁核的不溶性部分检测到种子。控制装置为10 n米重组原纤维（+）和仅缓冲液（−）样品。C、，从不溶性MSA小脑和基底神经节部分检测到种子。D、，来自匹配区域的对照不溶性脑样本没有表现出明显的接种。注：尸检银行没有提供PD1的杏仁核样本。*，第页<0.004，t吨与车辆处理条件进行比较。E、，除PD5外，PD可溶性组分没有表现出显著的播种活性，第页=0.0003开t吨与车辆处理条件相比的试验（Bonferroni事后校正为0.0028n个=19个比较）。F、，MSA可溶性组分含有显著的种子活性。*，第页< 0.0006,t吨与车辆处理条件进行比较。G、，来自区域匹配对照样品的可溶性组分没有显示出任何显著的种子。
图3。
图3。
PD和MSA总水平和磷酸化α-syn水平。 A–C通过ELISA测定PD-、MSA-和对照不溶性提取物中α-syn的浓度（μg/ml）。D–F之间，FRET检测的α-syn种子活性散点图与ELISA检测的α-syn总浓度进行比较。Spearman非参数双尾分析计算的相关系数：（PD，第页= 0.0017,第页= 0.8802; MSA、，第页= 0.0202,第页= 0.7333; 控制，第页= 0.7343,第页= 0.1044).G–I，免疫印迹法检测PD、MSA和对照组患者脑中总α-syn的不溶性提取物。J–L，通过与加载在相同印迹上的α-syn WT纤维的等效浓度进行比较，确定相对带密度。M–O，可溶性提取物总α-syn的免疫印迹。P–R，Western免疫印迹检测PD和MSA不溶性提取物中磷酸化α-syn，但不检测对照不溶性萃取物。S–U，可溶性提取物中未检测到磷酸化α-syn。
图4。
图4。
MSA和PD诱导不同形态的夹杂物。 A、，仅接种缓冲液（Opti-MEM）和脂多糖胺试剂的生物传感器细胞，10 n米重组α-突触原纤维，或来自PD（患者#5）前扣带回、PD#4杏仁核、MSA#4小脑和MSA#5基底神经节的不溶性提取物。箭头表示细胞内的典型聚集物；PD脑组织的局限性形态和MSA脑组织中的稀疏形态。比例尺为25μm。B、，接种缓冲液（对照）和10n的细胞的共焦照片米重组α-原纤维并用DAPI复染。比例尺在所有共焦照片上为25μm。C、，每个脑样本的共焦照片显示，从PD不溶性提取物和MSA不溶性和不溶性萃取物中提取的聚集体之间存在一致的形态差异。可溶PD组分未按预期生成聚集物。比例尺为10μm。
图5。
图5。
细胞内包涵体显示与聚集标记物共定位。 A、，接种PD、MSA和重组原纤维的生物传感器细胞均显示出与X34染色共定位的内含物。0需要缓冲区，原纤维为10 n米重组α-原纤维，PD INS（PD-INS）是4号PD患者的前扣带不可溶部分，MSA惯性导航系统是MSA患者#5基底节不可溶部分，MSA SOL公司为5号患者基底节可溶性部分。B、，p62/SQSTM1（PD-INS（#4杏仁核）、MSA-INS（#4基底神经节）和MSA-SOL（#4基础神经节））的内含物同样阳性。C、，pSer-129染色同样阳性（PD-INS（#4杏仁核）、MSA-INS（#4基底节）和MSA-SOL（#5基底节））。全部比例尺为10μm。箭头用各自的标记证明包裹体的共定位。CFP/YFP和(天)X34(E类)第62/SQSTM1页，以及(F类)pSer-129，*，第页<0.0001，通过单因素方差分析，Dunnett的多重比较为0（对照）。
图6。
图6。
保存第二代细胞转化后的包涵体形态。 A、，实验范式。生物传感器细胞接种MSA或PD脑的不溶性或可溶性提取物。3天后，提取种子细胞并获得可溶性和不溶性部分。这些细胞提取物用于接种原始生物传感器细胞，并在额外的3天培养后，通过荧光显微镜对细胞进行内含物评估。B、，生物传感器细胞接种不溶性或可溶性细胞提取物，这些提取物来自最初接种PD或MSA脑不溶性和可溶性提取物的细胞群体。注意包涵体形态的保存，以及与脑组织需要细胞相关的播种模式。图像放大倍数为×40，比例尺25微米。图像包括PD sol/sol，患者#4杏仁核；PD鞋垫/鞋垫，#5杏仁核；MSA sol/sol，#5小脑；MSA内垫/内垫=#4基底神经节。C、，对照HEK293T细胞缺乏α-syn过度表达或生物传感器细胞过度表达α-syn（A53T）-CFP/YFP（G1），接种大脑提取物（MSA或PD），并在3天的培养期后连续提取。可溶性和不溶性细胞提取物用于接种生物传感器细胞（G2）。在添加外源种子后，表达α-syn的生物传感器细胞有效地向第二代生物传感器细胞（G2）传播种子活性和包涵体形态。缺乏α-syn过度表达的HEK293T细胞由于携带残余种子而无法有效传播病理学。与HEK293细胞相比，所有组分中的种子活性通过生物传感器细胞传递的效率更高。*，第页= 0.0005t吨测试。采用两种不同的方法（流式细胞术和组织学细胞计数）对两个不同PD患者大脑的两个区域（#4和#5前扣带回和杏仁核）和两个不同MSA患者大脑的二个区域（#2和#3，小脑和基底神经节）复制结果。天和E、，连续提取G1和G2需要的细胞，免疫印迹分析部分显示总α-syn。在MSA不溶性组分中有聚集形式的α-syn，但在PD或对照样品中没有。P（P）=PD，M（M）=MSA，抄送=对照组织，A类=前扣带回，C类=小脑，B类=基底神经节，Y=杏仁核，0=缓冲接种阴性对照，F=重组原纤维接种对照（10 n米).F类和G、，连续提取G1-和G2-需要的细胞，并通过Western blotting评估α-syn磷酸化形式的α-syn。在可溶性和不溶性形式中，MSA中的磷酸化α-syn水平和磷酸化α-syn的聚集形式均高于PD。
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