跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2018年8月24日；7(1):19-31.
doi:10.1016/j.jcmgh.2018.08.005。 2019年eCollection。

NHE8缺乏通过Lgr5表达细胞的扩增促进小鼠结肠炎相关癌

华旭 1, 李静（音译） 1, 郝晨 2, 费耶兹·K·吉山 三
附属公司

NHE8缺乏通过Lgr5表达细胞的扩增促进小鼠结肠炎相关癌

华旭等。 细胞分子胃肠肝素. .

摘要

背景和目标：在结直肠癌（CRC）中检测到Lgr5过表达，包括一些结肠炎相关的CRC病例。在结肠炎相关的CRC中，慢性炎症是致癌的一个促成因素。我们最近报道了肠道Na+/H（H）+交换器亚型8（NHE8）在肠粘膜保护中起着重要作用，NHE8表达缺失会导致溃疡性结肠炎样症状。因此，我们假设NHE8可能参与肠道肿瘤的发展。

方法：我们通过免疫组织化学方法评估了人类CRC中NHE8的表达，并使用偶氮甲烷/右旋糖酐硫酸钠结肠癌模型研究了NHE8基因敲除（KO）小鼠的肿瘤负担。我们还评估了HT29的细胞增殖NHE8KO公司HT29异种移植NOD-scidγ（NSG）小鼠的细胞和肿瘤生长评估NHE8KO公司细胞。为了验证Lgr5和NHE8表达之间是否存在关系，我们通过聚合酶链反应和原位杂交分析了NHE8KO小鼠中Lgr5的表达。在结肠类器官培养中证实了Lgr5的表达和NHE8缺乏时的细胞增殖。还分析了β-catenin和c-Myc的表达，以评估Wnt/β-catentin的激活。

结果：NHE8在人CRC组织中未检测到。虽然在偶氮甲烷/右旋糖酐硫酸钠结肠癌模型中，只有9%的NHE8野生型小鼠出现肿瘤发生，但NHE8KO小鼠（89%）发生肿瘤的几率几乎是NHE8小鼠的10倍。在没有NHE8的情况下，HT29中发现了较高的菌落形成单位NHE8KO公司细胞。在NSG小鼠中，HT29的位置出现较大的肿瘤NHE8KO公司注射细胞与HT29比较NHE8野生型细胞。此外，NHE8缺乏导致结肠、HT29衍生肿瘤和类结肠中Lgr5表达增加。NHE8的缺失也增加了Wnt/β-catenin的活化。

结论：NHE8可能是调节肠道Wnt/β-catenin的内在因子。

关键词：AOM，偶氮甲烷；结直肠癌；CRISPR/Cas9，簇状规则间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白9；大肠肿瘤；DMEM，Dulbecco改良Eagle介质；右旋糖酐硫酸钠；增强型绿色荧光蛋白EGFP；乙二胺四乙酸，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；荧光激活细胞分选仪；KO，击倒；Lgr5；NHE、Na+/H+交换器；NHE8；NSG，NOD scid伽玛；聚合酶链反应；溃疡性结肠炎；野生型；mRNA，信使RNA。

PubMed免责声明

数字

无
图形摘要
图1
图1
NHE8在正常结肠组织和大肠腺癌中的表达。按照材料和方法部分所述的程序，从亚利桑那大学病理实验室获得的人类结肠组织切片与NHE8抗体反应。上部面板：正常结肠粘膜的H&E染色(左边)和大肠腺癌(正确的).下部面板正常结肠粘膜NHE8免疫组织化学染色(左边)和大肠腺癌(正确的). NHE8在结肠上皮衬里中强烈表达，癌细胞失去NHE8表达。NHE8标记为红色，细胞核标记为蓝色。NHE8免疫组织化学图片下方的数字（平均值±SD）表示NHE8染色的荧光强度。
图2
图2
AOM/DSS诱导NHE8WT和NHE8KO小鼠结肠肿瘤。NHE8KO和NHE8WT雄性小鼠（7–8周龄）以7.4 mg/kg体重的剂量经腹腔注射AOM。AOM给药5天后，小鼠在饮用水中给予2%DSS 5天，然后常规饮水14天。DSS/水处理重复3次。最后一次DSS治疗后，用常规水喂养小鼠28天，然后处死以进行进一步分析。WT、NHE8WT小鼠；KO、NHE8KO小鼠。(A类)AOM/DSS治疗计划。(B类)测量AOM/DSS治疗小鼠的体重、结肠长度和肿瘤。(C类)AOM/DSS处理的NHE8WT和NHE8KO小鼠结肠表面的形态学观察。从AOM/DSS处理的小鼠中收集结肠组织，然后切开暴露结肠内的管腔以观察肿瘤。这张图片是AOM/DSS处理的NHE8WT和NHE8KO小鼠的代表性图片。这个圈子图中显示肿瘤。(天)AOM/DSS处理的NHE8WT和NHE8KO小鼠肿瘤的组织学评估。对远端结肠的组织进行固定和切片。H&E染色显示组织形态。顶部面板：来自4只NHE8WT小鼠和4只NHE8KO小鼠的H&E染色图像。底部面板：在荷瘤小鼠中显示炎症、浸润、腺瘤和腺癌的典型图像。
图3
图3
HT29人结肠细胞中不含NHE8的集落形成试验。(A类)HT29中NHE8表达的Western blot检测NHE8重量和HT29NHE8KO公司细胞。用NHE8KO CRISP/Cas9 DNA转染HT29细胞。转染72小时后制备总细胞裂解物。用NHE8抗体检测NHE8蛋白在这些细胞中的表达。该数字显示了NHE8在细胞中的相对表达水平。HT29，未转染NHE8KO CRISP/Cas9 DNA的细胞；HT29-KO，转染NHE8KO CRISP/Cas9 DNA的细胞。(B类)集落形成单位分析。HT29型NHE8重量和HT29NHE8KO公司细胞接种在24孔培养板中，密度为1000个细胞/孔，培养10天。根据材料和方法一节中描述的程序，用结晶紫染色细胞。然后对微孔进行检查，并对菌落进行计数。顶部面板：染色培养池的代表性图像。底部面板：菌落计数的汇总数据。结果为3孔细胞的平均值±SD。T检验用于检验统计显著性*P（P）HT29小于.01NHE8重量电池（HT29）与HT29NHE8KO公司电池（HT29-KO）。(C类)HT29衍生肿瘤nhe8重量和HT29NHE8KO公司细胞。HT29型nhe8重量和HT29NHE8KO公司将细胞（100μL/注射部位的1000000个细胞）分别注射到NSG小鼠的左侧和右侧。注射后四周，处死小鼠并检查肿瘤。顶部面板：异种移植NSG小鼠肿瘤的代表性图片。底部面板：肿瘤重量和肿瘤大小的汇总数据。结果为9只小鼠的平均值±SD。T检验用于检验统计显著性*P（P）HT29小于.01NHE8重量电池（HT29）与HT29NHE8KO公司电池（HT29-KO）。
图4
图4
NHE8在隐窝和结肠干细胞中的表达。(A类)NHE8WT小鼠结肠隐窝基底部NHE8的免疫组织化学染色。远端结肠组织被固定并切片。用NHE8抗体检测NHE8的表达和定位。在地穴中，几乎在地穴底部的所有细胞中都检测到NHE8。NHE8标记为红色，细胞核标记为蓝色。(B类)PCR检测干细胞（Lgr5）中NHE8的表达+)和非干细胞（Lgr5-). 从4只Lgr5-EGFP雄性小鼠中分离出结肠隐窝，并制备单细胞悬液用于FACS。从结肠隐窝、干细胞和非干细胞中纯化总RNA。实时PCR检测NHE8在这些样本中的表达。这个条形图显示了分离的隐窝和FACS分选细胞的PCR结果。
图5
图5
NHE8功能缺失时Lgr5表达改变。(A类)从结肠组织中纯化总RNA并用于实时PCR检测Lgr5的表达。结果显示为平均值±标准差。T检验用于检验统计显著性。左侧面板：8只小鼠（4只/组）正常NHE8WT和NHE8KO结肠中Lgr5的表达*P（P）对于NHE8WT小鼠（WT）与NHE8KO小鼠（KO），<.015。中间面板：12只小鼠（6只/组）AOM/DSS NHE8WT和NHE8KO结肠中Lgr5的表达*P（P）AOM/DSS处理的NHE8WT小鼠（WT）与AOM/DSS-处理的NHE 8KO小鼠（KO）的差异小于.01。右侧面板：Lgr5在8种来源于HT29的肿瘤中的表达NHE8重量和HT29NHE8KO公司细胞（4个肿瘤/组）*P（P）HT29小于.01NHE8重量电池（HT29）与HT29NHE8KO公司电池（HT29-KO）。(B类)使用NHE8WT（WT）和NHE8KO（KO）小鼠结肠组织切片进行Lgr5原位杂交。左侧面板：原位杂交实验的代表性图像。右侧面板：在2只小鼠中观察到的42个隐窝Lgr5-阳性细胞计数的汇总数据（平均值±SD）。采用T检验检验统计学意义*P（P）NHE8WT小鼠（WT）与NHE8KO小鼠（KO）的差异小于.0001。(C类)使用由AOM/DSS处理的NHE8WT（AOM/DSS-WT）和NHE8KO（AOM/DSS-KO）小鼠制备的小鼠结肠组织切片进行Lgr5原位杂交。根据制造商的说明红色点反映Lgr5在组织切片中的表达水平。在AOM/DSS处理的NHE8KO小鼠的组织切片中可以看到强烈的Lgr5信号（由更多更大的红点表示）。
图6
图6
类结肠中Lgr5的表达和细胞增殖。根据材料和方法一节中描述的程序，收集3-4只小鼠（年龄为7-8周）的整个结肠，并用于隐窝分离。将最终的地穴颗粒与Matrigel混合，并播种在24孔培养板中。在含有Wnt3a–R-spondin–noggin的条件培养基中培养类结肠。每3-4天更换一次培养基，每5-7天传代一次类结肠。(A类)克隆培养5天，然后收集进行总RNA纯化。实时PCR检测Lgr5的表达。结果为6个单独实验的平均值±SD。采用T检验检验统计学意义*P（P）NHE8WT结肠（WT）与NHE8KO结肠（KO）<.01。(B类)结肠类有机物培养5天，然后根据制造商的说明用EdU标记。用共焦显微镜观察标记细胞。左侧面板：来自NHE8WT（WT）和NHE8KO（KO）小鼠的在基质胶中生长的活结肠的代表性图像。右侧面板：EdU标签后的有机物。红色，EdU标记的细胞；蓝色，细胞核染色。
图7
图7
CTNNB1和c-Myc表达检测。从AOM/DSS结肠组织和异种移植瘤中纯化总RNA。实时PCR检测CTNNB1和c-Myc的表达。为了进行ß-catenin免疫组织化学染色，使用AOM/DSS小鼠的组织切片与\223»-catentin抗体反应。(A类)AOM/DSS处理的NHE8WT（WT）和NHE8KO（KO）小鼠中CTNNB1和c-Myc的表达。结果为8只小鼠（4只/组）的平均值±SD。采用T检验检验统计学意义*P（P）NHE8WT小鼠（WT）vs NHE8KO小鼠（KO）<.0004。(B类)HT29来源的异种移植瘤中CTNNB1和c-Myc的表达NHE8重量和HT29NHE8KO公司细胞。结果是4-7个肿瘤的平均值±SD。采用T检验检验统计学意义*P（P）HT29小于.02NHE8重量电池（HT29）与HT29NHE8KO公司电池（HT29-KO）。(C类)AOM/DSS诱导肿瘤中β-catenin的检测。远端结肠的组织被固定并切片。根据材料和方法一节中描述的程序，使用抗ß-catenin的抗体检测\223»-catentin的表达和定位。左侧面板：NHE8WT小鼠的代表性图像(顶部)和NHE8KO小鼠(底部). 在正常组织中，ß-catenin位于质膜附近。在肿瘤组织中，ß-catenin在细胞内和/或细胞核内移位。赖特：AOM/DSS处理小鼠β-catenin蛋白表达的Western blot检测结果。结果为6只小鼠（3只小鼠/组）的平均值±标准差。采用T检验检验统计学意义*P（P）AOM/DSS处理的NHE8WT小鼠（WT）与AOM/DSS-处理的NHE 8KO小鼠（KO）的差异小于.05。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 膜转运蛋白在肠癌中的作用。
    Saksena S，Dudeja PK公司。 Saksena S等人。 细胞分子胃肠肝素。2019;7（1）：241-242。doi:10.1016/j.jcmgh.2018.09.016。Epub 2018年10月28日。 细胞分子胃肠肝素。2019 PMID：30585160 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Ghishan F.K.，Kiela P.R.小肠离子转运。胃肠病学当前操作。2011;28:130–134.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Orlowski J.，Grinstein S.哺乳动物钠/质子交换器SLC9基因家族的多样性。Pflugers架构。2004;447:549–565.-公共医学
    1. Zachos N.C.、Tse M.、Donowitz M.肠道钠/氢交换的分子生理学。生理学年度修订。2005;67:411–443.-公共医学
    1. Xu H.，Chen H.，Dong J.，Lynch R.，Ghishan F.K.钠氢交换异构体8（NHE8）细胞生理生化的胃肠道分布和动力学表征。2008;21:109–116.-公共医学
    1. Xu H.，Chen R.，Ghishan F.K.大鼠肠钠氢交换器亚型8的亚克隆、定位和表达。美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2005;289：G36–G41。-公共医学

出版物类型

MeSH术语