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.2019年2月5日；93（4）：e01786-18。
doi:10.1128/JVI.01786-18。 2019年2月15日打印。

一种新型甲型流感病毒基因组中核苷酸替换缺陷干扰粒子

萨沙·杨·库普克 1, 迪特马尔·里德尔 2, 蒂莫·弗伦辛 三 4, 帕维尔·兹莫拉 三, 乌多·赖奇尔 三 4
附属公司

一种新型甲型流感病毒基因组中核苷酸替换缺陷干扰粒子

萨沙·杨·库普克等。 J维罗尔. .

摘要

缺陷干扰粒子（DIP）复制的代价是共同感染完全传染性的同源病毒。通常，它们含有高度缺失的病毒基因组。利用单细胞分析，我们发现了一种未知的DIP型病毒，它来源于甲型流感病毒（IAV），称为OP7病毒。与参考序列相比，第7段（S7）的基因组病毒RNA（vRNA）没有缺失，而是携带37个点突变，影响启动子区域、编码蛋白和基因组包装信号。联合感染实验表明，OP7病毒对IAV复制有强烈干扰，表现为释放的病毒感染性显著降低。此外，在细胞内和释放的病毒群中观察到S7相对于其他基因组片段的超比例数量。同时，OP7病毒缺乏其他vRNA片段的大部分，这似乎构成了其在病毒复制中的缺陷。OP7病毒可能成为抗病毒治疗的一个很有希望的候选者。此外，这种新型DIP也可能存在于其他IAV制剂中。重要性缺陷干扰粒子（DIP）通常含有高度缺失的病毒基因组，使其在病毒复制中有缺陷。然而，通过与完全传染性标准病毒（STV）共感染进行互补后，可以观察到对病毒生命周期的干扰，导致STV复制受到抑制，并释放出主要是非感染性DIP。有趣的是，最近的研究表明DIP可能是一种抗病毒药物。在这里，我们报道了一种未知类型的甲型流感病毒衍生的DIP（称为“OP7”病毒）的发现，该病毒在其基因组中含有许多点突变，而不是大量缺失。此外，导致OP7病毒干扰和明显缺陷的基本原理似乎与传统DIP不同。总之，我们认为OP7病毒可能是抗病毒治疗的一个有希望的候选者。此外，它对病毒复制和宿主细胞反应都有很强的影响，在其他IAV制剂中可能被忽视。

关键词：有缺陷的干扰粒子；甲型流感病毒；单细胞分析。

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数字

图1
图1
单细胞分析工作流程和病毒滴度对S7 vRNA水平的依赖性。（A） 实验方法的方案。将IAV感染的MDCK细胞胰蛋白酶化，连续稀释，并转移到384孔板。通过显微镜鉴定含有单个细胞的微孔。在12 hpi时，通过菌斑试验定量上清液中的病毒滴度，并通过实时RT-qPCR定量细胞内vRNA。（方案改编自参考文献）（B、D和F）vRNA水平对病毒产量的影响。颜色突出病毒释放，只要有意义；否则，细胞是蓝色的。奇偶校验线(第页 = 1） 显示供参考。（C、E和G）病毒滴度的分布。实线表示概率密度函数（通过核密度估计计算）。细胞内vRNAs和释放的PFU（非感染细胞）检测均为阴性的细胞被排除在MOI为1（F和G）时进行的感染分析之外。插图包括来自多个独立实验的汇集数据(n个对于面板B和C，＝4，产生119个单元；n个=面板D和E为4，产生149个单元；和n个=面板F和G为3，产生132个单元）。
图2
图2
qPCR扩增子的熔化曲线分析。感染的单个MDCK细胞（来源于MOI为10时感染PR8-NIBSC的细胞群体，如上所述[图1A]）培养至12 hpi，然后通过实时RT-qPCR检测其细胞内vRNA。qPCR后，进行熔化曲线分析。（A） vRNA片段之间的相关性。具有等摩尔和超比例S7水平（与S5相比）的细胞分别显示为红色和绿色。（B） qPCR扩增子的熔化曲线。T、 温度；dF/dT，荧光变化除以温度变化。（C） 熔点比较。误差条表示所示平均值的标准偏差。显示了一个代表性实验的结果，产生了38个细胞。
图3
图3
OP7病毒的富集。（A） 单细胞衍生病毒种子的产生。感染的单个MDCK细胞（来自于MOI为10时感染PR8-NIBSC的细胞群体，如上所述[图1A]）培养至12 hpi。随后，在融合的MDCK细胞中扩增整个上清液（包含所有子代病毒）。四个独立的实验产生了55个病毒种子，其中五个分离物显示出明显的OP7病毒表型（面板B和图4）。（改编自参考文献）（B和D）受感染的单个MDCK细胞中vRNA片段之间的相关性。使用选定的OP7（B）和PP（D）种子病毒（分别显示在面板A和面板C中的制剂）以10的MOI感染MDCK细胞。然后按照上述方法分离单个细胞（图1A）。在12 hpi时，通过实时RT-qPCR检测细胞中的vRNAs。进行了独立实验，每个实验使用一个病毒种子，每个种子产生31到40个单细胞测量值。奇偶校验线(第页 = 1） 显示供参考。（C） 斑块净化程序方案。从PR8-NIBSC病毒中提取斑块，在三次连续分析中重新接种，最后在融合的MDCK细胞中繁殖。两个独立的实验产生了43个PP病毒分离物。
图4
图4
基于细胞群体的OP7种子病毒感染。（A） OP7和PP种子病毒的感染性和vRNA含量（分别来自图3A和图C）。通过TCID对感染病毒滴度进行量化50检测，并通过实时RT-qPCR定量纯化病毒的vRNA。数据用于根据病毒颗粒浓度（源自HA滴度）计算感染病毒的分数和每种病毒的vRNAs数量。每种病毒的vRNAs标准化基于PR8-RKI病毒（作为参考）。（B） 使用A组中显示的种子病毒进行高MOI实验的结果，在MOI为10时感染MDCK细胞，在12 hpi时检测细胞内vRNA含量。对于产生的病毒，给出了感染性和每种病毒的vRNAs。在独立实验中进行PR8-RKI和PR8-NIBSC病毒的感染实验(n个=3），每种OP7和PP种子病毒一次。误差条表示所示平均值的标准偏差。
图5
图5
病毒颗粒中的亚基因组vRNAs。在MOI为10时感染MDCK细胞释放的病毒（来自图4B所示的实验），在12 hpi下通过片段特异性RT-PCR研究S1到S8上是否存在亚基因组vRNAs。FL和DI vRNA分别出现在凝胶的顶部和底部。
图6
图6
ns-TEM成像的病毒颗粒。感染MDCK细胞（MOI）释放的病毒 = 10; 12 hpi）（图4B图例中描述的实验）。（A至C）PR8-RKI（A）、OP7（B）和PP（C）病毒的代表性病毒颗粒。棒材，50 纳米。（D） 根据ns-TEM图像确定的病毒粒子直径。对于非球形粒子，我们确定了长度和宽度的平均值。分别为PR8-RKI、OP7和PP病毒测定了16、17和23个病毒的直径。误差条表示标准偏差。***，P（P） < 0.001（按学生）t吨测试。
图7
图7
基因组S7-OP7 vRNA中的核苷酸替换。（A）vRNA序列的比较。序列由高MOI下释放的病毒决定（来自图4B所示的实验）。（B） S7-OP7 vRNA功能区的变化。核苷酸和氨基酸（aa）位置分别用黑色和绿色数字表示。（C和D）启动子区采用的旋塞结构。材料和方法中提供了所有vRNA序列的GenBank登录号（见“数据可用性”）。
图8
图8
OP7种子病毒感染细胞中的病毒RNA合成。通过实时RT-qPCR和WB检测感染MOI为10的MDCK细胞的细胞内病毒RNA和病毒蛋白含量。（A） vRNA、mRNA和cRNA数量的细胞内动力学。（B至D）细胞内病毒蛋白积累的WB分析。（E） 在12 hpi诱导先天免疫反应。通过实时RT-qPCR测量IFN-β和Mx1的表达水平，并使用ΔΔC类T型方法。PR8-RKI感染在独立实验中进行(n个=3），每种OP7种子病毒一次。误差条表示所示平均值的标准偏差。
图9
图9
OP7种子病毒感染后细胞内M1和vRNP定位动态。对感染的MDCK细胞（MOI）进行成像流式细胞术分析 = 10） 。（A和B）M1（A）和vRNP（B）的核定位动力学。分别使用7-AAD或DAPI对细胞进行M1或vRNP和细胞核染色。根据与核信号共定位的荧光信号量计算细胞核中M1或vRNP的分数。每个样本共评估10000个单细胞。PR8-RKI病毒感染在独立实验中进行(n个=3），每种OP7种子病毒一次。误差条表示图示平均值的标准偏差。面板B中所示数据的统计分析如图10所示。（C和D）9 hpi（C）下M1和18 hpi（D）下vRNP染色的代表性细胞图像。描述了一个代表性实验的面板。
图10
图10
核vRNP定位动力学的统计分析。对感染的MDCK细胞（MOI）进行成像流式细胞术分析 = 10). 对细胞进行vRNP和细胞核染色。根据与核信号共定位的荧光信号量计算细胞核中vRNP的分数。每个样本共评估10000个单细胞。在独立实验中进行PR8-RKI病毒感染(n个=3）和每种OP7种子病毒（即OP7-3、OP7-4和OP7-5病毒）各一次（见图9）。收集OP7种子病毒感染的数据集进行分析。误差条表示所述平均值的标准偏差。*，P（P） < 0.05; **,P（P） < 0.01（由学生t吨测试）。
图11
图11
PR8-RKI病毒感染的MDCK细胞与OP7种子病毒的联合感染。以10的MOI感染PR8-RKI病毒的MDCK细胞同时以指示的MOI与OP7种子病毒共感染，直到12hpi。感染性病毒滴度通过菌斑试验定量，细胞内和病毒纯化的vRNA通过实时RT-qPCR定量。数据用于计算感染病毒的分数和每种病毒的vRNAs数量，使用HA滴度得出的病毒颗粒浓度。每种病毒的vRNAs标准化基于PR8-RKI病毒（作为参考）。进行了三个独立的感染实验，每个实验使用PR8-RKI和一个OP7种子病毒。
图12
图12
OP7病毒对不同IAV株在不同细胞系中复制的干扰。在MOI为10时感染WT病毒的细胞同时在指定的MOI处感染OP7种子病毒，直到12 hpi。（A和B）用OP7种子病毒共同感染PR8 RKI感染的人HEK 293（A）和A549（B）细胞系。（C和D）OP7病毒对H1N1-pdm09（C）和H3N2（D）病毒在MDCK细胞中复制的干扰。感染性病毒滴度通过菌斑试验定量，细胞内和病毒纯化的vRNA通过实时RT-qPCR定量。数据用于计算感染病毒的分数以及使用病毒颗粒浓度计算每个病毒粒子的vRNAs数量（源自HA滴度）。每种病毒的vRNAs标准化基于PR8-RKI病毒（作为参考）。分别使用WT和一种OP7种子病毒进行了三次独立的感染试验。
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