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.2018 11月10日;6:32。
DOI:101038/S41413-018-030-Y。 收集2018。

NUBB通过促进成骨细胞泛素化促进PTEN和GLI1降解维持骨量

附属
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NUBB通过促进成骨细胞泛素化促进PTEN和GLI1降解维持骨量

凌晔等。 骨矿. .
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摘要

适配器蛋白NUMB参与非对称分裂和细胞命运测定,并被确认为Notch的拮抗剂。以前的研究已经证明,成骨细胞中的缺口激活有助于高骨量。然而,在这项研究中,9周龄的小鼠使用成骨细胞特异性的骨形成表型。COL1A1-2.3-CRE烧蚀两个麻木的及其同源物纽姆布尔. 骨小梁质量显著下降,皮质骨块不受影响。这里,Notch信号未被激活,而在人类染色体10(PTEN)上缺失的张力素同源物,其去磷酸化磷脂酰肌醇3激酶,升高,衰减蛋白kinase B(Akt)。泛素化分析显示,在神经前体细胞表达的发育下调蛋白4-1的存在下,NUMB可能在生理上促进PTEN泛素化。此外,还存在不足之处。麻木的/纽姆布尔还通过GLI1激活刺猬途径。这一过程可提高核因子KB配体受体激活剂与骨保护素的比值,增强破骨细胞分化和骨吸收。总之,本研究提供了新的功能NUBB和NUBBL对骨稳态的洞察。

利益冲突陈述

作者宣称没有竞争利益。

数据

图1
图1
双重敲除麻木的纽姆布尔在体内引起骨量减少和抑制骨形成。9周龄WT或DKO小鼠股骨的代表性三维(3D)图像。股骨远端冠状切面,尺杆,1毫米。股骨生长板(I)、尺杆、100μm、生长板(II)和300级节段(Ⅲ)、尺杆、100μm的横断面骨小梁的三维重建。C生长板、鳞片、100μm以下500级皮质骨的横断面图像。骨微结构三维结果的定义和描述D骨体积分数(BV/TV)。e小梁数(TB.N)。f)小梁厚度TTHG皮质骨厚度Ct结果显示,每组至少5只小鼠的平均±SD,分别描述男性和女性。H股骨远端石蜡切片用H.E鳞棒100μm染色。I用Von Kossa(黑色)染色的股骨远端冰冻切片,用Van Gieson(红色)复染。刻度杆,200μm。J用钙黄绿素(绿)和二甲酚橙(红色)对小梁骨进行双重标记。骨组织由钙黄绿素蓝(Blue)、鳞片棒、50μm矿物附着率标记。K()N~(10)和矿物表面率L(MS/BS,N用双标记法评价了定量(10)。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。每小梁骨周长成骨细胞数(N.OB/T.PM,N甲苯胺蓝染色后,γ=10)定量。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。N骨钙素浓度(OCN)N用ELISA法测定血清中γ=12。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05
图2
图2
这个麻木的纽姆布尔成骨细胞的切割抑制增殖和分化,促进细胞凋亡。骨髓基质细胞(BMSCs)在完全培养基中培养,第7天用成骨分化培养基进行处理。碱性磷酸酶染色法(碱性磷酸酶染色法)在第7天(红色)和Von Kossa染色上进行(在第29天进行标记矿化基质(黑色)。C成骨基因mRNA水平碱性磷酸酶BSPOCNCOL1A1)和(D关键转录因子Runx2OSX)用RT-qPCR对BMSCs培养物进行分析,并将其归类为β-肌动蛋白。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。eRunx2和OsX的Western印迹用腺病毒GFP(CTRL)或腺病毒Cre GFP(δN/NL)病毒转染N/NL融合小鼠的颅骨成骨细胞,并在成骨培养基中进行培养。GAPDH用于归一化。f腺病毒感染后21天进行Von Kossa染色。G骨标志物的定量RT-PCR结果碱性磷酸酶BSPOCNCOL1A1DMP1菲克斯)转染CRE后2天。β-肌动蛋白用于归一化。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。H第2天的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EDU)染色(绿色)的代表性图像以评估细胞增殖;用DAPI(蓝色)对细胞核进行复染。刻度杆,50μm。IEDU阳性细胞在DAPI阳性细胞正常化后定量。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。J细胞增殖标志物(细胞增殖标志物)细胞周期蛋白A2,细胞周期蛋白D1细胞周期素E1)成骨细胞中的δN/NL。β-肌动蛋白用于归一化。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。K第2天用流式细胞仪检测成骨细胞凋亡的点图。Annexin V-PE在FL2中进行扫描,7个AAD在FL3中扫描。L细胞凋亡标志物的QRT-PCR结果p53Bcl-2BCL—Xβ-肌动蛋白用于归一化。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。裂解Caspase-3的Western印迹法。GAPDH用于归一化
图3
图3
这个麻木的纽姆布尔缺陷促进PTEN而不是Notch。三重QRT-PCR检测Notch靶基因的表达HES1HES5HYY1海尔NUB、NICD、HES1和PTEN的蛋白印迹在δN/NL成骨细胞中变化。在腺病毒转导后两天提取全细胞裂解物和RNA。GAPDH用于归一化。C用RBP JK报告物或阳性/阴性对照质粒瞬时转染δN/NL和CTRL成骨细胞。建立AD NICD(阳性)和DAPT(阴性)的额外对照,以观察该试验的效率。荧光素酶水平归一化Renilla luciferase,并呈现为折叠变化监测缺口活化。误差条表示三重转染的标准偏差。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。DWT和DKO小鼠股骨石蜡切片的抗PTEN(红色)免疫染色和红蓝蛋白染色(蓝核)。黑色和蓝色箭头分别指骨表面上或附近的阳性信号。刻度杆,100μm。ePTEN特异性抑制剂在δN/NL成骨细胞中挽救了凹陷的成骨。VO OHPIC(5μm)与δN/NL成骨细胞共孵育。茜素红用于标记矿化基质。f骨标志物(骨标志物)Ocn、COL1A1和DMP1增殖标记物细胞周期蛋白A2,细胞周期蛋白D1和凋亡标志物(p53,bcl-2数据被归类为β-肌动蛋白。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。AKT中信号分子的Western印迹G)和mTOR通路(MTOR通路)HGAPDH用于归一化
图4
图4
NUMB促进PTEN在成骨细胞中的泛素化。原代颅骨成骨细胞中NUB与PTEN的共免疫沉淀细胞裂解物与抗NUB(兔)免疫沉淀(免疫沉淀)抗PTEN(兔)或兔IgG和抗PTEN(山羊)免疫印迹或抗麻木(山羊)分别分离抗体。CNUMB促进PTEN的泛素化。与GFP共转染MC3T3-E1细胞M -麻木绿色荧光蛋白-M-泛素国旗M PTEN质粒。用抗标记抗体(山羊)对细胞提取物进行免疫沉淀,并用抗泛素(兔)鉴定共沉淀泛素。DNEDD4-1参与了PTEN在MC3T3-E1细胞中的泛素化。用FLAG-M共转染细胞。NEDD4-1GFP-M-泛素和标志MPTEN质粒。LANE 5显示用10μm Mg132孵育6小时的细胞,并用DMSO孵育1~4条细胞。用抗PTEN抗体(山羊)对细胞提取物进行免疫沉淀,并用抗泛素(兔)鉴定共沉淀泛素。eNADD4-1在原代颅骨成骨细胞中与NUDB共免疫沉淀。细胞裂解物用抗NUB(山羊)或山羊IgG免疫沉淀,用抗NUB(兔)抗体免疫印迹。f没有NEDD4-1的参与,NUMB对PTEN泛素化的调节不可能实现。MC3T3-E1细胞与GFP M质粒共转染麻木的GFP- M泛素,标志PTEN和SINEDD4. 转染2天后,细胞裂解。用反标记琼脂糖珠将PTEN下拉,并用抗泛素免疫印迹检测泛素化PTEN(Ub PTEN)。
图5
图5
淘汰赛麻木的纽姆布尔成骨细胞促进破骨细胞生成。WT和DKO股骨石蜡切片上的TRAP染色显示骨表面破骨细胞。刻度杆,50μm。抗酒石酸酸性磷酸酶5(ACP5)的浓度NWT或DKO小鼠血清中γ= 12)。数据表示平均值±SEM,*<<0.05。基于TRAP染色的组织形态计量学:C每松质骨周长破骨细胞数(N.Oc/T.PM);Nα=10);D破骨细胞表面率(O.S.S/BS,N(=)10;e)破骨细胞平均表面(OC表面)Nα=10)。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。fWT或DKO颅盖骨(下层)成骨细胞与WT或DKO小鼠在48孔板中的BMC(TOP)共培养,TRAP染色和苏木精染色。G破骨细胞计数计数,平均值为±SEM,*<<0.05。H从扫描电子显微镜(SEM)的骨吸收坑代表性图像。刻度杆,400μm。I将RAW264.7细胞在48孔板上培养,在TRAIL N/NL或CTRL成骨细胞表面共培养,并进行TRAP染色。J 麻木的在成骨细胞中过度表达促进破骨细胞生成。GFP- M转染的成骨细胞麻木的质粒。转染2天后,将RAW264.7细胞接种于成骨细胞表面,10天后用威尔斯诱捕细胞。K在0.4μm孔的小孔突插入物上进行Nd/NL或CTRL成骨细胞的转孔培养;RAW264.7细胞与24孔板共培养,10天后进行TRAP染色。
图6
图6
这个麻木的减弱的成骨细胞通过Hedgehog途径增强RANKL/OPG。qRT-PCR结果甲状旁腺激素释放激素甲状旁腺激素转录变化。qRT-PCRs归一化为β-肌动蛋白,数据表示平均值±SEM,*<<0.05。mRNA和(C用qRT-PCR和Western blot分别检测成骨细胞中GLY1-3蛋白的表达水平。qRT-PCRs正常化为β-肌动蛋白,Western blot数据归一化为α- tubin。D两个代表性的石蜡切片WT和DKO股骨免疫组化染色抗GLI1(红色,黑色箭头)和苏木精染色。蓝箭头表示WT小鼠中麻木的适度表达。刻度尺20μm。e用Western blot法检测成骨细胞中磷酸化CREB(P CREB)的形成,并用LAMIN B.归一化。f Mcsf,兰克尔光学参量振荡器成骨细胞在δN/NL中的表达qRT-PCRs正常化为β-肌动蛋白。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。兰克尔G)和OPGH在条件培养基中从δN/NL和CTRL成骨细胞培养中收集水平,用ELISA法测定。RANKL/OPG比值显著增加(RANKL/OPG比值)IN= 12。所示数据代表平均值±SEM,*<<0.05。GLI1特异性抑制减弱成骨细胞的破骨细胞诱导作用JC57 B6小鼠经GANT58(2.5或7.5μmol·L)孵育12小时后,接种于C57 B6小鼠成骨细胞上。- 1)或二甲基亚砜。12天后,威尔斯进行TRAP染色和苏木精染色。
图7
图7
麻木的纽姆布尔成骨细胞维持生理骨量。当在成骨细胞中正常表达时,NUBN-NEDD4-PTEN三复合物产生,导致泛素介导的PTEN蛋白酶体降解。同时,GLY1在蛋白酶体中趋于降解。Akt和Hedgehog信号在成骨细胞中是中度的。什么时候?麻木的PTEN和GLI1在细胞质中积聚,它们抑制Akt抑制骨形成并激活刺猬以增强骨吸收。

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