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.2018年11月19日;9(12):1145.
doi:10.1038/s41419-018-1197-2。

p62/SQSTM1在缺乏Smpd1基因的血管平滑肌细胞PDGF-BB诱导的肌纤维母细胞样表型转变中的作用

附属公司

p62/SQSTM1在缺乏Smpd1基因的血管平滑肌细胞PDGF-BB诱导的肌纤维母细胞样表型转变中的作用

张鹏(音译)等。 细胞死亡病. .

摘要

越来越多的证据表明,自噬在动脉粥样硬化形成过程中调节血管平滑肌细胞(SMC)稳态中起着关键作用。然而,自噬在PDGF-BB诱导的SMC向合成表型和细胞外基质重塑转变中的调节作用尚不清楚。我们最近证实,酸性鞘磷脂酶(ASM,由Smpd1基因编码)控制冠状动脉平滑肌细胞的自噬成熟。在这里,我们证明PDGF-BB刺激导致Smpd1中肌纤维母细胞样非标准合成表型转变-/-SMC。PDGF-BB在Smpd1中诱导的这些非典型表型变化-/-SMC的特征是成纤维细胞特异性蛋白(FSP-1)表达增加,I型胶原大量沉积,细胞尺寸减小,炎症状态升高,细胞因子释放和粘附分子表达增强。从机制上讲,PDGF-BB诱导Akt激活延长,导致自噬体生物发生减少,从而增加Smpd1中p62/SQSTM1的积累-/-SMC。更重要的是,Akt抑制或p62/SQSTM1基因沉默可减弱PDGF-BB诱导的Smpd1表型变化-/-SMC。Smpd1中p62/SQSTM1依赖性肌纤维母细胞样表型转变的首次证明-/-SMCs提示ASM介导的自噬途径有助于维持动脉粥样硬化期间血管重塑情况下动脉平滑肌的稳态。

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数字

图1
图1。PDGF诱导细胞增殖和形态学的变化Smpd1型+/+Smpd1型−/−SMC。
血管平滑肌细胞用PDGF-BB(30纳克/毫升)h或指示的时间段。细胞周期分析Smpd1型+/+Smpd1型−/−存在或不存在PDGF-BB的SMC(30ng/ml)。条形图显示了Smpd1型+/+Smpd1型−/−细胞核位于细胞周期的G0/1、S和G2/M期。*P(P) < 0.05时,**P(P) < 0.01(n个 = 4,双向方差分析).b类免疫印迹分析和总结数据显示细胞周期蛋白D1在Smpd1型+/+Smpd1型−/−存在或不存在PDGF-BB的SMC。*P(P) < 0.05(n个 = 4,双向方差分析)。c(c)基于流式细胞术的细胞计数Smpd1型+/+Smpd1型−/−用PDGF-BB处理的SMC。*P(P) < 0.05时,**P(P) < 0.01(n个 = 4,双向方差分析)。,e(电子)细胞形态ECIS分析。细胞接种在ECIS阵列室中24小时添加PDGF-BB之前的h(虚线a)。阻抗Smpd1型+/+Smpd1型−/−通过ECIS分析在100范围内监测SMCh.虚线b表示曲线的最低阻抗值Smpd1型−/−用PDGF-BB治疗SMCe(电子)显示虚线a和b之间的电阻变化(n个= 4).(f)用DAPI(蓝色)表示SMC中α-SMA(绿色)或F-actin(红色)的免疫荧光图像。实验重复了至少三次,结果相似
图2
图2。的影响Smpd1型基因消融对血管壁厚度和SMC迁移潜能的影响。
主动脉α-SMA(红色)和弹性蛋白纤维(绿色)的免疫荧光染色Smpd1型+/+Smpd1型−/−老鼠。用天狼星红染色法检测主动脉中胶原的表达。AOI:天狼星红胶原染色扩大区域的感兴趣区域。b条,c(c)SMC迁移潜能的离体主动脉芽分析。主动脉环来自Smpd1型+/+Smpd1型−/−用PDGF-BB(30ng/ml)或车辆控制5天。b条显示主动脉环α-SMA(红色)和DAPI(蓝色)染色的代表性免疫荧光图像。下部面板b条显示主动脉环移位的图像。量化数据c(c)显示主动脉环中SMC萌芽的数量以及每个分支生长的所有分支的总长度,以反映迁移距离。*P(P) < 0.05(n个 = 6)
图3
图3。PDGF-BB促进肌纤维母细胞样分化Smpd1型−/−SMC。
SMC处于控制状态或受PDGF-BB刺激(30ng/ml)。典型的western blot显示SM22、α-SMA和Calponin的蛋白表达。b条波形蛋白、胶原蛋白I和FSP-1的代表性免疫印迹分析。c(c)上述免疫印迹的总结数据。*P(P) < 0.05时,**P(P) < 0.01(n个 = 4) 。对照条件下或PDGF-BB刺激下SMC的天狼星红染色(30纳克/毫升)小时。e(电子)根据天狼星红染色结果检查总胶原蛋白量。*P(P) < 0.05时,**P(P) < 0.01(n个 = 4). 基因型和治疗作为类别因素的双向方差分析。(f)典型的western blot显示TGF-β1在Smpd1型+/+Smpd1型−/−PDGF-BB刺激前后的SMC。实验重复了至少三次,结果相似
图4
图4。Smpd1型基因消融加剧了PDGF诱导的SMC炎症。
典型图像(左)和细胞定量(右)显示ASM缺乏和PDGF-BB刺激对单核细胞(绿色)募集的影响。SMC用30ng/ml PDGF-BB或24小时等量的车辆h,然后与钙-AM标记的单核细胞共培养30用荧光显微镜进行显微镜观察,用流式细胞仪通过门控钙阳性细胞进行细胞计数。放大倍数,×200*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01(n个 = 4). 免疫荧光(b条)和流式细胞术(c(c))细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达分析Smpd1型+/+Smpd1型−/−PDGF-BB刺激前后的SMC。IL-6和IL-18 mRNA表达的实时RT-PCR分析Smpd1型+/+Smpd1型−/−PDGF-BB刺激前后的SMC。*P(P) < 0.05时,**P(P) < 0.01(n个 = 6)
图5
图5。Smpd1型基因消融损害SMC的自噬通量。
所示为流式细胞术分析CytoID绿色荧光的代表性直方图Smpd1型+/+Smpd1型−/−用对照或CQ(氯喹)治疗的SMC。b条免疫印迹和自噬标记的总结数据Smpd1型+/+Smpd1型−/−SMC处于控制状态。c(c)串联RFP-GFP-LC3B转染SMC的典型荧光图像显示自噬体和自噬溶酶体的形成。自吞噬体在合并图像中显示为黄色或橙色斑点(RFP-GFP-LC3B),而合并图像中的红色斑点(RFP-LC3B。汇总数据显示合并图像中自噬体(黄色/橙色斑点)和自噬溶酶体(红色斑点)的数量。*P(P) < 0.05(n个 = 4)
图6
图6。PDGF-BB诱导的肌纤维母细胞样转变需要自噬抑制Smpd1型−/−SMC。
p62/SQSTM1和LC3B的免疫印迹和总结数据Smpd1型+/+Smpd1型−/−用对照品或PDGF-BB(30ng/ml)*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01(n个 = 4) 。b条GFP-LC3B表达的SMC接种在8孔Lab-Tek®培养箱载玻片中,可适应12个h、 并保持在控制条件下或暴露于PDGF-BB(30ng/ml)进行4次h.报告代表性图像和定量数据*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01(n个 = 6).c(c)免疫印迹和FSP-1的总结数据Smpd1型+/+Smpd1型−/−用对照品或PDGF-BB(30纳克/毫升)*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01(n个 = 6).
图7
图7。PDGF-BB诱导的肌成纤维细胞转化需要持续的Akt激活Smpd1型−/−SMC。
典型图像和定量数据显示PDGF-BB(30ng/ml)对in中Akt和Erk-1/2磷酸化的影响Smpd1型+/+Smpd1型−/−SMC*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01(n个 = 4) 。b条,c(c)典型图像和定量数据显示Akt抑制剂LY294002(50μmol/l)对PDGF-BB诱导的Akt磷酸化、p62/SQSTM1和FSP-1变化的影响Smpd1型+/+Smpd1型−/−SMC。SMC接受或不接受PDGF-BB治疗(30ng/ml)进行2次Akt磷酸化或24小时h用于分析p62/SQSTM1和FSP-1*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01(n个 = 4) 。IL-6和IL-18 mRNA表达的实时RT-PCR分析Smpd1型−/−经或不经PDGF-BB处理的SMC(30纳克/毫升)在有或无LY294002(50μmol/l)的情况下,放置h。*P(P) < 0.05时,**P(P) < 0.01(n个 = 6).e(电子)典型的免疫荧光图像Smpd1型+/+Smpd1型−/−经或不经PDGF-BB处理的SMC(30ng/ml)在有或无LY294002(50μmol/l)的情况下持续24h.实验重复至少三次
图8
图8。Akt-p62/SQSTM1轴有助于PDGF-BB诱导的肌成纤维细胞样表型转变Smpd1型−/−SMC。
Smpd1型−/−SMC感染p62/SQSTM1 shRNA或干扰shRNA慢病毒颗粒,然后用PDGF-BB(30  纳克/毫升)  小时。典型的免疫印迹和总结数据显示p62/SQSTM1在Smpd1型−/−SMCs感染p62/SQSTM1 shRNA或干扰shRNA(SC)慢病毒颗粒*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01(n个 = 3).b条PDGF-BB或载体治疗后IL-6和IL-18 mRNA表达的实时RT-PCR分析Smpd1型−/−带有p62/SQSTM1静音或不静音的SMC。*P(P) < 0.05时,**P(P) < 0.01(n个 = 6).c(c)典型的免疫印迹和总结数据显示p62/SQSTM1 shRNA对PDGF-BB诱导的FSP-1和TGF-β1蛋白表达的影响Smpd1型−/−方案管理委员会
图9
图9。抑制Nrf2活化减弱PDGF-BB诱导的IL-6产生Smpd1型−/−SMC。
免疫印迹显示Nrf2在全细胞裂解物或核提取物中的表达Smpd1型+/+Smpd1型−/−经或不经PDGF-BB处理的SMC(30纳克/毫升)h.实验重复三次。b条免疫荧光图像显示Nrf2(绿色)在Smpd1型+/+Smpd1型−/−经或不经PDGF-BB处理的SMC(30纳克/毫升)h.细胞核用DAPI(蓝色)染色。实验重复了三次。c(c)免疫印迹显示Nrf2 shRNA或干扰shRNA(SC)对Nrf2表达的效率Smpd1型−/−SMC**P(P) < 0.01(n个 = 3).IL-6释放Smpd1型−/−SMC。Smpd1型−/−用Nrf2 shRNA或干扰shRNA转导SMC,然后用或不用PDGF-BB(30纳克/毫升)h.用ELISA测定IL-6。*P(P) < 0.05时,**P(P) < 0.01(n个 = 6)
图10
图10
ASM缺乏加速肌纤维母细胞样表型转变的机制 Smpd1型−/−PDGF-BB刺激后(详见讨论)

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引用人

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