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.2018年11月15日；9(1):4795.
doi:10.1038/s41467-018-07071-7。

Rcan1的条件性缺失易导致高血压介导的壁内血肿以及随后的动脉瘤和主动脉破裂

西尔维亚·维拉霍兹 1 2, 保拉·索菲亚·尤内斯·莱蒂斯 1 2, 内雷亚·曼德斯·巴贝罗 1 三, 卡蒂亚·乌尔索 1 4, 埃琳娜·邦佐·库利琴科 2 5, 萨格拉里奥·奥尔特加 6, J弗朗西斯科·尼斯塔尔 2 7, 何塞·瓦兹奎兹 2 5, 斯特凡·奥弗曼 8, 胡安·米盖尔·雷东多 9 10, 米盖尔·坎帕内罗 11 12
附属公司

Rcan1的条件性缺失易导致高血压介导的壁内血肿以及随后的动脉瘤和主动脉破裂

西尔维亚·维拉霍兹等。 国家公社. .

摘要

主动脉壁内血肿（IMH）可演变为再吸收、夹层或动脉瘤。高血压是IMH和动脉瘤患者最常见的诱发因素，而高血压介质血管紧张素II在小鼠中均可诱导这两种疾病。我们之前已经证明，Rcan1亚型的构成性缺失可以预防血管紧张素II诱导的小鼠动脉瘤。在这里，我们有条件地生成血管平滑肌细胞、内皮细胞或普遍缺乏每种或所有亚型的小鼠，以确定血管细胞中Rcan1亚型对动脉瘤形成的作用。令人惊讶的是，任何一种血管细胞类型的条件性Rcan1缺失都会诱导高收缩表型和主动脉中层紊乱，易患高血压介导的主动脉破裂、IMH和动脉瘤。这些过程被岩石抑制所阻断。我们发现Rcan1与GSK-3β相关，其抑制作用降低了肌球蛋白的激活。我们的结果确定了干预IMH和动脉瘤的潜在治疗靶点，并呼吁在解释构成性和诱导性缺陷小鼠的表型时要谨慎。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
可诱导的加拿大1缺失易导致主动脉破裂和IMH。一的示意图加拿大1轨迹和加拿大1亚型（转录本），指示外显子（框）和转录起始位点（箭头）。b条外显子1、4或6两侧LoxP位点（橙色框）的相对位置加拿大1-1飞行/飞行，Rcan1-4飞行/飞行，或加拿大1飞行/飞行分别是。c（c）实验设计。在植入用于AngII输注的渗透微型泵（1）之前，用三苯氧胺连续治疗小鼠5天（黑色箭头） 微克 公斤−1最小值−1). 对小鼠进行BP（红色箭头）监测，并在7天后实施安乐死。d日6-8周龄男性的生存曲线SM-Rcan1公司−/−(n个 = 20),EC-Rcan1号机组−/−(n个 = 18),Ubc-Rcan1号机组−/−(n个 = 11),加拿大1−/−(n个 = 17） 、和加拿大1+/+(n个 = 39）AngII渗透微泵植入后的小鼠。对数库（Mantel-Cox）测试**第页 < 0.01, *第页 < 0.05与加拿大1+/+所有死亡均因主动脉破裂所致。e（电子）实验结束前死亡小鼠主动脉破裂的代表性宏观图像（顶部）和苏木精-伊红染色切片（底部）。比例尺，1 mm（顶部）和200 µm（底部）。（f）实验结束时安乐死小鼠主动脉肉眼血肿的典型图像。比例尺，1 毫米。克AsAo、TDAo和AbAo实验结束时的IMH发病率。齐方分布****第页 < 0.0001与。加拿大1+/+;不适用.，非显著vs加拿大1+/+.小时主动脉切片的代表性图像加拿大1+/+,SM-Rcan1公司−/−,EC-Rcan1号机组−/−,Ubc-Rcan1号机组−/−、和加拿大1−/−苏木精-伊红染色的小鼠。比例尺，500 微米。我主动脉切面出血面积。每个数据点表示单个鼠标，而直方图表示平均值 ± s.e.m.Kruskal-Wallis与Dunn多重比较事后检验****第页 < 0.0001, ***第页 < 0.001, **第页 < 0.01与加拿大1+/+;不适用.，不显著vs。加拿大1+/+.d日——我 加拿大1+/+室友包括一组经车辆处理的Cre阳性和tamoxifen处理的Cre-阴性加拿大1飞行/飞行老鼠
图2
图2
加拿大1-1和加拿大1-4有助于主动脉内稳态。六个八周大SM-Rcan1-1−/−(n个 = 10),SM-Rcan1-4号机组−/−(n个 = 16） ，EC-Rcan1-1−/−(n个 = 7） 、和EC-Rcan1-4号机组−/−(n个 = 9） 雄性小鼠在接受AngII治疗的同时SM-Rcan1公司−/−(n个 = 20),EC-Rcan1号机组−/−(n个 = 18） 、和控制加拿大1+/+(n个 = 39）如图1所示的小鼠。定量数据SM-Rcan1公司−/−,EC-Rcan1号机组−/−、和控制加拿大1+/+因此，这两个数字是相同的。一生存曲线。对数库（Mantel-Cox）测试**第页 < 0.01, *第页 < 0.05对。加拿大1+/+所有死亡均因主动脉破裂所致。b条实验结束时安乐死小鼠主动脉肉眼血肿的典型图像。比例尺，1 毫米。c（c）相同小鼠的AsAo、TDAo和AbAo中IMH的发病率。齐方分布****第页 < 0.0001中**第页 < 0.01, *第页 < 0.05对。加拿大1+/+.d日所示基因型主动脉切片苏木精-伊红染色的代表性图像和e（电子） SM-Rcan1公司−/−,SM-Rcan1-1−/−、和SM-Rcan1-4号机组−/−小鼠和（f）从EC-Rcan1号机组−/−,EC-Rcan1-1−/−,EC-Rcan1-4号机组−/−、和控制加拿大1+/+老鼠。每个数据点表示单个鼠标，而直方图表示平均值 ± s.e.m.Kruskal-Wallis与Dunn多重比较事后检验****第页 < 0.0001, *第页 < 0.05对。加拿大1+/+.比例尺，500 微米。一——d日 加拿大1+/+室友包括一组经车辆处理的Cre阳性和tamoxifen处理的Cre-阴性加拿大1飞行/飞行老鼠
图3
图3
IMH有条件升级为AAA加拿大1−/−老鼠。一实验设计：6-8周龄雄性小鼠在植入渗透微型泵进行AngII输注（1 微克 公斤−1最小值−1). 用超声波（红色箭头）监测主动脉，用AngII治疗7或28天后对小鼠实施安乐死。7天后进行的分析数据如补充图7所示。b条经AngII治疗28天的小鼠AsAo和AbAo的典型超声图像。黄线和蓝线分别表示管腔边界和管腔直径。比例尺，1 mm.最大值(c（c）)AsAo和(d日)AngII治疗指定时间的AbAo直径。方框表示平均值的第25和75个百分位范围，方框中的线表示中值，晶须从最小值延伸到最大值。Tukey多重比较事后检验的双向方差分析(c（c）)和Kruskal-Wallis的Dunn多重比较事后检验(d日), **第页 < 0.01, *第页 < 0.05与加拿大1+/+; 不显著vs。加拿大1+/+.e（电子）AAA和主动脉扩张的发病率。正常，直径 < 1.2 毫米；膨胀，1.2 毫米 < 直径 < 1.5 毫米；AAA，直径 > 1.5 mm.方形分布***第页 < 0.001, **第页 < 0.01，与。加拿大1+/+.（f）AAA的代表性图片。比例尺，1 毫米。克用苏木精-伊红（HE）、马森三色（Masson）和弹性范吉森染色（EVG）染色的主动脉切片的代表性图像。比例尺，500μm。加拿大1+/+(n个 = 12),SM-Rcan1公司−/−(n个 = 7),EC-Rcan1号机组−/−(n个 = 11),Ubc-Rcan1号机组−/−(n个 = 6） 、和加拿大1−/−(n个 = 6).b条——克 加拿大1+/+室友包括一组经车辆处理的Cre阳性和tamoxifen处理的Cre-阴性加拿大1飞行/飞行老鼠
图4
图4
血管紧张素II的高血压作用是IMH形成所必需的。一实验设计：6-8周龄雄性小鼠在植入渗透微型泵输注AngII（1 微克 公斤−1最小值−1)和氨氯地平（Amlo，6 毫克 公斤−1白天−1). 监测小鼠的血压（血压；红色箭头），并在实验结束时对其实施安乐死。b条收缩压测量加拿大1+/+盐水处理的小鼠(n个 = 3） 、AngII(n个 = 6） 或Amlo plus AngII(n个 = 6). 采用Tukey多重比较事后检验的单向方差分析***第页 < 0.001, *第页 < 0.05与未治疗，###第页 < 0.001与AngII。c（c）生存曲线加拿大1+/+和SM-Rcan1公司−/−如图所示，用AngII和Amlo治疗的小鼠。对数库（Mantel-Cox）测试*第页 < 0.05对。加拿大1+/+AngII公司。所有死亡均因主动脉破裂所致。d日AngII或AngII治疗小鼠主动脉肉眼血肿的典型图像 + Amlo（比例尺，1 mm）和e（电子）这些小鼠的血肿发生率。齐方分布***第页 < 0.001与。加拿大1+/+AngII，###第页 < 0.001与。SM-Rcan1公司−/−AngII公司。（f）相同小鼠AbAo横截面的苏木精-伊红染色（比例尺，500 微米）和克这些部分的IMH面积量化显示为平均值 + s.e.m；每个数据点表示一个单独的鼠标。加拿大1+/+安哥拉II(n个 = 8),加拿大1+/+血管紧张素受体 + 阿姆洛(n个 = 6),SM-Rcan1公司−/−安哥拉II(n个 = 15） 、和SM-Rcan1公司−/−血管紧张素受体 + 阿姆洛(n个 = 6). Kruskal-Wallis与Dunn多重比较事后检验*第页 < 0.05对。加拿大1+/+AngII、###第页 < 0.001对SM-Rcan1公司−/−AngII公司。c（c）——克 加拿大1+/+室友包括一组经车辆处理的Cre阳性和tamoxifen处理的Cre-阴性加拿大1飞行/飞行老鼠
图5
图5
有条件的加拿大1−/−小鼠主动脉通透性增加。一（上图）6年后发现的肉眼可见的早期血肿的代表性图像 AngII输注h（1 微克 公斤−1最小值−1). 比例尺，1 mm。（中间和底部面板）这些血肿的苏木精-伊红染色。比例尺，100 微米。b条6岁以后主动脉IMH的发病率 注射AngII h加拿大1+/+(n个 = 14),SM-Rcan1公司−/−(n个 = 16） 、和EC-Rcan1号机组−/−老鼠(n个 = 12） 。齐方分布****第页 < 0.0001与。加拿大1+/+.c（c）小鼠主动脉正面（上图）和横截面（下图）Cd31免疫荧光的代表性图像 h与AngII。Cd31（灰色，顶部面板；绿色，底部面板），DAPI染色细胞核（蓝色）。比例尺，20 微米。d日显示FITC-标记的70-kDa葡聚糖（绿色）和罗丹明B-标记的10-kDa右旋糖酐（红色）在加拿大1+/+(n个 = 10),SM-Rcan1公司−/−(n个 = 16） 、和EC-Rcan1号机组−/−(n个 = 12） 注射6次的小鼠 h与AngII。弹性蛋白自身荧光也显示为绿色。主动脉也用抗Cd31（灰色）和DAPI（蓝色）染色。比例尺，50 微米。e（电子）荧光强度定量测定同一小鼠主动脉切片中（顶部）FITC-标记的70-kDa右旋糖酐和（底部）罗丹明B-标记的10-kDa左旋糖酐的积累；a.u.，任意单位。每个数据点表示单个鼠标，而直方图表示平均值 + s.e.m.Kruskal-Wallis与Tukey-Dunn多重比较事后检验****第页 < 0.0001中**第页 < 0.01, *第页 < 0.05与加拿大1+/+.b条——e（电子） 加拿大1+/+室友包括一组经车辆处理的Cre阳性和tamoxifen处理的Cre-阴性加拿大1飞行/飞行老鼠
图6
图6
诱导物中血管超微结构的改变和MLC的激活加拿大1−/−老鼠。一主动脉切片的典型透射电子显微镜（TEM）图像加拿大1+/+(n个 = 6),SM-Rcan1公司−/−(n个 = 6),EC-Rcan1号机组−/−(n个 = 6） 、和加拿大1−/−老鼠(n个 = 4). 五十、 流明；E、 弹性片层；vSMC，血管平滑肌细胞。红色星号在弹性层和vSMC之间用空格标记区域。棒材，2 微米。b条主动脉切片上弹性蛋白自身荧光（绿色）、DAPI染色细胞核（蓝色）、p-MLC（粉红色）和SMA（灰色）免疫荧光的代表性图像加拿大1+/+(n个 = 6),SM-Rcan1公司−/−(n个 = 6),EC-Rcan1号机组−/−(n个 = 6） 、和加拿大1−/−老鼠(n个 = 11). 比例尺，20 微米。c（c）DAPI染色（蓝色）、p-MLC（粉红色）和SMA（灰色）免疫荧光的代表性图像加拿大1飞行/飞行用Cre编码或控制慢病毒载体转导的vSMC。比例尺，20 微米。d日代表性p-MLC、Rcan1和微管蛋白免疫印迹加拿大1飞行/飞行用Cre-encoding或control慢病毒转导vSMCs并用ROCK抑制剂Fasudil（30 µM）用于1 小时(n个 = 3个独立实验）。一,b条 加拿大1+/+室友包括一组经车辆处理的Cre阳性和tamoxifen处理的Cre-阴性加拿大1飞行/飞行老鼠
图7
图7
ROCK介导MLC激活和主动脉疾病。一代表性p-MLC、Rcan1和微管蛋白免疫印迹加拿大1飞行/飞行用Cre-encoding或control慢病毒转导vSMCs并用ROCK抑制剂Fasudil（30 µM）用于1 小时(n个 = 3个独立实验）。b条实验时间表。黑箭，三苯氧胺注射液。一组小鼠用Fasudil（1 mg/ml饮用水）。红色箭头，BP测量。红色箭头，Fasudil开始治疗（−2），AngII渗透微泵植入（0），实验结束（7）。c（c）根据该方案治疗的6-8周龄雄性小鼠的存活曲线b条如图所示。盐分 = AngII处理：加拿大1+/+(n个 = 7),SM-Rcan1公司−/−(n个 = 10） 、和EC-Rcan1号机组−/−(n个 = 11); 法苏迪尔 = 法苏迪尔 + AngII治疗：加拿大1+/+(n个 = 8),SM-Rcan1公司−/−(n个 = 7） 、和EC-Rcan1号机组−/−(n个 = 11). 对数库（Mantel-Cox）测试*第页 < 0.05与加拿大1+/+AngII（盐类）#第页 < 0.05对。SM-Rcan1公司−/−AngII（盐水）&第页 < 0.05对。EC-Rcan1号机组−/−AngII（盐类）。所有死亡均因主动脉破裂所致。d日主动脉肉眼血肿的代表性图像（比例尺，1 mm）和e（电子）这些小鼠的血肿发生率。齐方分布*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，与。加拿大1+/+盐分##第页 < 0.01与。SM-Rcan1公司−/−盐水，第页 < 0.05对。EC-Rcan1号机组−/−盐分。（f）这些小鼠AbAo切片中HE染色的代表性图像（比例尺，500 微米）和克这些部分的IMH面积量化显示为平均值 ± s.e.m。；每个数据点表示一个单独的鼠标。Kruskal-Wallis与Tukey-Dunn多重比较事后检验**第页 < 0.01, *第页 < 0.05对。加拿大1+/+盐分#第页 < 0.05与SM-Rcan1公司−/−盐分&&第页 < 0.01与EC-Rcan1号机组−/−盐分。小时同一小鼠主动脉提取物的代表性p-MLC免疫印迹。采用Tubulin作为负荷控制。c（c）——小时 加拿大1+/+室友包括一组经车辆处理的Cre阳性和tamoxifen处理的Cre-阴性加拿大1飞行/飞行老鼠
图8
图8
GSK-3β介导诱导物MLC活化加拿大1−/−老鼠。一实验设计。大脑蛋白质提取物加拿大1+/+和加拿大1−/−用抗Rcan1抗体免疫沉淀小鼠，用质谱鉴定相互作用蛋白，并用光谱计数定量。b条显著丰富的蛋白质（学生t吨-测试，第页 < 0.05）在来自加拿大1+/+和加拿大1−/−根据提取物在3个独立实验中的富集情况列出了提取物。c（c）用抗Rcan1抗体（IP Rcan1）或对照抗体（IP IgG）免疫沉淀的vSMC蛋白提取物与粗提取物（输入）进行Gsk-3β和Rcan1免疫印迹分析。d日主动脉提取物的代表性p-MLC、β-连环蛋白和微管蛋白（负荷控制）免疫印迹分析加拿大1+/+,SM-Rcan1公司−/−、和EC-Rcan1号机组−/−老鼠(n个 = 3个独立实验）。e（电子）主动脉提取物的代表性β-连环蛋白和微管蛋白（负荷控制）免疫印迹分析加拿大1+/+(n个 = 7),加拿大1−/−(n个 = 6） 和SM-Rcan1公司−/−(n个 = 8） 老鼠。d日,e（电子） 加拿大1+/+室友包括一组经车辆处理的Cre阳性和tamoxifen处理的Cre-阴性加拿大1飞行/飞行老鼠。（f）代表性图片(n个 = 3） p-MLC免疫荧光（灰色）和DAPI染色（蓝色）加拿大1飞行/飞行用Cre-encoding或control慢病毒转导vSMCs并治疗2 用生理盐水或GSK-3β抑制剂LiCl（50 µM）或抑制剂VIII（GSK-3βi）（10 微米）。比例尺，20 微米。克代表性Rcan1、p-MLC和β-catenin免疫印迹分析(n个 = 3） 在vSMC中（f）Gapdh用作加载控制。小时描述GSK-3β和ROCK介导的条件下主动脉IMH、主动脉夹层和AAA诱导的模型加拿大1−/−高血压应激小鼠。而高血压导致自发性小IMH复发加拿大1+/+在大多数条件下，小鼠处于低频加拿大1−/−诱导大IMH的小鼠分离或进展为动脉瘤
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