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.2018年12月21日;38(6):英国标准20180696。
doi:10.1042/BSR20180696。 2018年12月21日印刷。

减少microRNA-182-5p有助于阿仑膦酸钠通过Rap1/MAPK途径促进骨质疏松症患者成骨细胞的增殖和分化

附属公司

减少microRNA-182-5p有助于阿仑膦酸钠通过Rap1/MAPK途径促进骨质疏松症患者成骨细胞的增殖和分化

宝龙盘等。 Biosci代表. .

摘要

骨质疏松症(OP)是一个严重的健康问题,导致骨质疏松性结构损伤和骨脆性。MicroRNAs(miRNAs)可以在骨内分泌方面发挥重要作用。因此,阐明miRNAs在骨内分泌生理和病理中的表达和功能,对提高代谢相关骨疾病的潜在治疗价值具有重要意义。我们通过Rap1/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路靶向腺苷酸环化酶亚型6(ADCY6),探讨了阿仑膦酸钠(ALN)治疗后,microRNA-182-5p(miR-182-5p)对OP大鼠成骨细胞增殖和分化的影响。建立OP大鼠模型,观察ALN对OP的影响,并检测miR-182-5p、ADCY6和Rap1/MAPK信号通路相关基因的表达。为了确定miR-182-5p和ADCY6在ALN治疗后OP中的作用,初步验证了miR-182和ADCY6之间的关系。随后提取成骨细胞并转染miR-182-5p抑制剂、miR-182.5p模拟物、si-ADCY6和MAPK信号通路抑制剂U0126。同时检测细胞增殖、凋亡和分化情况。ALN治疗能够缓解OP.miR-182-5p负向靶向ADCY6抑制Rap1/MAPK信号通路的症状。转染miR-182抑制剂的细胞降低了ALP、BGP和COL I的表达,表明miR-182-5p的下调促进了细胞分化和增殖,抑制了细胞凋亡。总之,本研究表明,下调miR-182-5p通过上调ADCY6激活Rap1/MAPK信号通路促进OP大鼠成骨细胞的增殖和分化,这可能是OP治疗的新靶点。

关键词:ADCY6;阿伦膦酸盐;MicroRNA-182;成骨细胞;骨质疏松症;Rap1/MAPK信号通路。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明,与手稿没有任何利益冲突。

数字

图1
图1。ALN治疗显著改善OP症状
(A类)HE染色(40×)显示ALN治疗对大鼠股骨组织病理学改变的影响;(B类)假手术组、OP组和ALN组CD34和RANK的免疫组织化学染色(400×);ALN,阿仑膦酸盐;HE,苏木精-伊红;OP,骨质疏松;RANK,NF-KappaB受体激活剂。
图2
图2。ALN治疗降低OP细胞凋亡
(A类)TUNEL染色显示凋亡细胞(400×);(B类)股骨组织AI;*,P(P)< 0.05与。假手术组,P(P)< 0.05与。OP组;ALN,阿仑膦酸盐;OP,骨质疏松症;TUNEL、TdT介导的dUTP-生物素缺口末端标记试验;AI,凋亡指数。
图3
图3。MiR-182-5p上调,而ADCY6和Rap1/MAPK信号通路在ALN治疗后受到抑制
(A类)ALN治疗后ADCY6、ERK1、ERK2、Rap1和P38 MAPK的miR-182-5p表达和mRNA水平;(B类)ALN处理后ADCY6、ERK1/2、p-ERK1/2,P38 MAPK、p-P38 MAPK和Rap1蛋白带的灰度值;(C类)ADCY6、ERK1/2、Rap1和P38 MAPK的蛋白水平以及ALN处理后ERK1/2和P38 MAPK磷酸化的程度;*,P(P)< 0.05.假手术组;#,P(P)< 0.05OP组。MiR-182-5p,microRNA-182-5p;OP,骨质疏松;ADCY6,腺苷酸环化酶6。
图4
图4。成骨细胞培养成功
(A类)成骨细胞的形态(原始放大倍数为100倍);(B类)成骨细胞的ALP图像(原始放大倍数为200倍);(C类)成骨细胞茜素红染色图像(原始放大倍数为100倍)。碱性磷酸酶染色。
图5
图5。ADCY6是miR-182-5p的靶基因
(A类)根据在线预测网站分析,ADCY6 3′UTR与miR-182-5p序列之间的结合区域;(B类)转染后ADCY6 Wt和ADCY6-Mut的荧光素酶活性;*,P(P)< 0.05NC组。腺苷酸环化酶6;NC,阴性对照;miR-182-5p,microRNA-182-5p。
图6
图6。MiR-182-5p抑制ADCY6的表达并抑制Rap1/MAPK信号通路
(A类)miR-182-5p模拟物、miR-182.5p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-1825p抑制剂+U0126治疗后miR-182-5 p的表达及ADCY6、ERK1、ERK2、P38 MAPK和Rap1的mRNA水平;(B类)miR-182-5p模拟物、miR-182.5p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-1825p抑制剂+U0126处理后,ADCY6、ERK1/2、p-ERK1/2,P38 MAPK、p-P38 MAPK和Rap1蛋白带的灰度值;(C类)ADCY6、ERK1、/2、Rap1和P38 MAPK的蛋白水平以及ERK1/2和P38 MAPK磷酸化的程度,以响应miR-182-5p模拟物、miR-182-5抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-182-5p抑制剂+U0126的治疗;*,P(P)< 0.05.空白组和NC组;#,P(P)< 0.05miR-182-5p抑制剂组;OP,骨质疏松;腺苷酸环化酶6;Rap1、Ras-related protein 1;丝裂原活化蛋白激酶;ERK,细胞外信号调节激酶;miR-182-5p,microRNA-182-5p。
图7
图7。miR-182-5p的下调促进成骨细胞增殖
(A类)MTT法测定miR-182-5p模拟物、miR-182.5p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-1825p抑制剂+U0126治疗后的OD值;(B类)miR-182-5p模拟物、miR-182.5p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-1825p抑制剂+U0126处理后PCNA蛋白带的灰度值;(C类)miR-182-5p模拟物、miR-182-5 p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-182-5p抑制剂+U0126治疗后PCNA蛋白水平的变化;*,P(P)< 0.05.空白组和NC组;#,P(P)< 0.05miR-182-5p抑制剂组。NC,阴性对照;增殖细胞核抗原;miR-182-5p,microRNA-182-5p。
图8
图8。下调miR-182-5p促进成骨细胞分化
(A类B类)miR-182-5p模拟物、miR-182.5p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-1825p抑制剂+U0126治疗后的ALP活性和BGP活性;(C类)对miR-182-5p模拟物、miR-182.5p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-1825p抑制剂+U0126处理的ALP、BGP、COL I和BMP2蛋白带灰度值;(D类E类)miR-182-5p模拟物、miR-182.5p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-1825p抑制剂+U0126治疗后COL I的mRNA和蛋白水平;(F类G公司)miR-182-5p模拟物、miR-182.5p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-1825p抑制剂+U0126治疗后ALP的mRNA和蛋白水平;(H(H))响应于miR-182-5p模拟物、miR-182-5p抑制剂、si-ADCY6、miR-182-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-182-5p抑制剂+U0126的处理的BMP2的mRNA和蛋白水平。*,P(P)< 0.05.空白组和NC组;#,P(P)< 0.05miR-182-5p抑制剂组。碱性磷酸酶;骨钙素;Ⅰ型胶原;NC,阴性对照;miR-182-5p,microRNA-182-5p。
图9
图9。下调miR-182-5p抑制成骨细胞的细胞周期进展和细胞凋亡
(A类)描述细胞进程的细胞周期图;(B类)定量分析miR-182-5p模拟物、miR-182.5p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-1825p抑制剂+U0126治疗后的细胞周期进展;(C类)流式细胞术图谱显示细胞凋亡状况;(D类)miR-182-5p模拟物、miR-182.5p抑制剂、si-ADCY6、miR-82-5p抑制剂+si-ADCY6、U0126或miR-1825p抑制剂+U0126治疗后细胞凋亡率分析;*,P(P)< 0.05.空白组和NC组;#,P(P)< 0.05miR-182-5p抑制剂组;NC,阴性对照;miR-182-5p,microRNA-182-5p。

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