Vitronectin from brain pericytes promotes adult forebrain neurogenesis by stimulating CNTF

doi:10.1016/j.expneurol.2018.11.002

.2019年2月：312:20-32。

doi:10.1016/j.expnerol.2018.11.002。 Epub 2018年11月6日。

脑周细胞中的Vitronectin通过刺激CNTF促进成人前脑神经发生

贾翠红¹, 马修·普·凯西¹, 汉娜·M·马龙¹, 奇哈鲁·洛文斯¹, 理查德·桑特¹, 弗拉德·拉兹斯卡佐夫斯基¹, 西奥·哈格²

附属机构

¹美国田纳西州约翰逊市东田纳西州立大学奎伦医学院生物医学系，邮编37614。
²美国田纳西州约翰逊市东田纳西州立大学奎伦医学院生物医学系，邮编37614。电子地址：haggt1@etsu.edu。

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内政部： 2016年10月10日/j.expneuro.2018.11.002

来自脑周细胞的透明质凝集素通过刺激CNTF促进成年前脑神经发生

贾翠红等。实验神经学. 2019年2月.

.2019年2月：312:20-32。

doi:10.1016/j.expnerol.2018.11.002。 Epub 2018年11月6日。

作者

贾翠红¹, 马修·普·凯西¹, 汉娜·M·马龙¹, 奇哈鲁·洛文斯¹, 理查德·桑特¹, 弗拉德·拉兹斯卡佐夫斯基¹, 西奥·哈格²

附属机构

¹美国田纳西州约翰逊市东田纳西州立大学奎伦医学院生物医学系，邮编37614。
²美国田纳西州约翰逊市东田纳西州立大学奎伦医学院生物医学系，邮编37614。电子地址：haggt1@etsu.edu。

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摘要

玻璃体凝集素（VTN）是血液中的一种糖蛋白，具有止血作用。VTN也存在于各种器官的细胞外基质中，但对其在健康成人组织中的功能知之甚少。我们发现，在成年小鼠中，心室下区（SVZ）约一半的周细胞独特地表达VTN，在SVZ中，神经发生贯穿一生。脑内注射VTN抗体或敲除VTN可降低神经发生以及前神经原性CNTF、抗神经原性LIF和IL-6的表达。相反，注射VTN或VTN+/+血浆，但不注射VTN-/-小鼠，会增加这些细胞因子。当联合应用gp130抑制剂抑制LIF和IL-6时，VTN促进SVZ神经发生。出乎意料的是，VTN抑制了FAK信号，而VTN-/-小鼠增加了SVZ中的FAK信号。此外，FAK抑制剂或VTN增加了CNTF的表达，但在条件性星形胶质细胞FAK基因敲除小鼠中没有，这表明VTN通过抑制星形胶质细胞中的FAK增加CNTF。这些结果确定了周细胞衍生的VTN在大脑中的新作用，它通过CNTF、LIF和IL-6的共同表达调节SVZ神经发生。VTN-integrin-FAK和gp130信号可能为细胞替代疗法提供诱导神经发生的新靶点。

关键词：星形胶质细胞；细胞因子；粘着斑激酶；神经发生；体外凝集素；gp130信令。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1。 — **图1.VTN在成年小鼠脑血管周围细胞中表达。**
共聚焦图像显示SVZ中的VTN免疫染色(A类)和纹状体(B类). 箭头表示VTN阳性细胞的示例。细胞核用DAPI（蓝色）染色。插图（A）显示了冠状切面上SVZ（i）和纹状体（ii）图像的位置。（B）中的两个插图显示纹状体中两条微血管周围有VTN阳性细胞。LV=侧心室，BV=血管。比例尺如图所示。C类)VTN−/−小鼠未出现VTN阳性染色，验证了抗体的特异性。D类)VTN阳性细胞位于内皮标记物CD31确定的纹状体血管分叉点。E类)SVZ中的VTN阳性细胞与内皮细胞紧密结合，表现为与CD31缺乏共定位(F类).G-I公司)SVZ中的VTN阳性细胞与DCX阳性神经母细胞没有共同定位。（G，H）中箭头所示的VTN阳性细胞显示在共焦z堆叠的一个1μm厚的部分(我).

图2。 — **图2.VTN在成年小鼠SVZ的周细胞中独特表达。**
VTN与周细胞标记物PDGFRβ共定位**A-C公司**)和CD13D-F公司)如SVZ的共焦图像所示。（C，F）中所示的箭头以较高的放大倍数显示J型)以及**K（K）**). VTN阳性细胞与GFAP阳性星形胶质细胞密切相关**G-I公司**). 箭头所示的单元格在中以较高的放大倍数显示**L（左）**)以及**M（M）**). （A）中的插图显示了此图中SVZ图像的位置。LV=侧脑室。比例尺如图所示。

图3。 — **图3 VTN抑制或缺失降低了SVZ中CNTF、LIF和IL-6的表达以及细胞增殖。**
A类)24小时后，纹状体内注射VTN抗体降低了C57BL/6小鼠邻近SVZ中的CNTF、IL-6和LIF mRNA。数据为平均值+SEM，计算为IgG的倍数变化（n=5和5只小鼠，*p<0.05，**p<0.01，Student t检验）。B类)通过半巢式RT-qPCR检测，与VTN+/+小鼠相比，VTN−/-小鼠SVZ中CNTF、IL-6和LIF的mRNA水平较低。数据为平均值+SEM，计算为VTN+/+小鼠的折叠变化（n=5和9只小鼠，*p<0.05，**p<0.01，Student’s t检验）。C类)每日注射3次BrdU后，通过成年VTN+/+和VTN−/−小鼠的SVZ在冠状切片上进行BrdU免疫染色的代表性图像显示VTN+/-小鼠SVZ的增殖减少。LV=侧脑室，STR=纹状体，CC=胼胝体。D类)SVZ中BrdU阳性细胞核的无偏体视学计数证实，VTN−/−小鼠的细胞增殖比VTN+/+小鼠少约18%（n=4和5只小鼠，*p<0.05，学生t检验）。E类)成年小鼠背外侧SVZ中DCX（红色）免疫染色的代表性图像显示，与VTN+/+小鼠相比，VTN−/−SVZ中的成神经细胞减少。细胞核用Hoechst（蓝色）染色。F类)SVZ中DCX阳性细胞的量化证实，VTN−/−小鼠的成神经细胞比VTN+/+小鼠少约24%（n=4和5只小鼠，*p<0.05，学生t检验）。**G公司**)SVZ背外侧DCX（红色）和BrdU（绿色）免疫染色的代表性图像显示VTN−/-小鼠SVZ中BrdU标记的神经母细胞减少。VTN中BrdU-DCX共标记细胞的高倍放大（G箭头）+/+**H-J公司**)和VTN−/−**K-M公司**)小鼠展示了计数细胞的例子。N个)SVZ中BrdU--DCX联合标记细胞的量化证实，VTN−/−小鼠的神经发生率比VTN+/+小鼠低约63%（n=4和5只小鼠，***p<0.001，学生t检验）。

图4。 — **图4 VTN注射增加SVZ中CNTF、LIF和IL6的表达。**
纹状体内注射rhVTN增加A类)CNTF、，B类)Il-6和C类)24小时后，VTN+/+和VTN−/−小鼠SVZ中的LIF mRNA。数据为平均值+SEM，计算为PBS VTN+/+小鼠组平均值的折叠变化。如蛋白质印迹所示，VTN也增加了同一小鼠的CNTF蛋白水平(D类)和密度测定量化(E类). 白介素-6F类)和LIFG公司)ELISA显示，相同小鼠的蛋白质水平增加（每组n=5、5、4和5。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，双向方差分析，随后进行事后Tukey多重比较试验）。在单独的小鼠中，纹状体内注射从VTN+/+（而不是VTN−/−）收集的血浆可增加CNTF(**H（H）**)，IL-6(我)和LIF(J型)24小时时VTN+/+和VTN−/−小鼠SVZ中的mRNA表达。数据为平均值+SEM，并计算为PBS VTN+/+小鼠组平均值的倍数变化（n=8、7和8只VTN+/+小鼠/组，n=5、3和6只VTN−/−小鼠/组。*或#p<0.05，**或#p<0.01，***或##p<0.001，双向方差分析，随后进行事后T ukey多重比较测试）。

图5。 — **图5：当gp130抑制剂抑制LIF和IL-6表达时，VTN增加SVZ神经发生。**
纹状体内注射rhVTN和gp130受体抑制剂SC144均不影响A类)VTN诱导C57BL/6小鼠SVZ中CNTF的表达，但抑制VTN诱导的B类)IL-6和C类)LIF公司。数据为平均值+扫描电镜（SEM），计算为载体（Veh，1%二甲基亚砜）组平均值的折叠变化（n=9，7，5和6只小鼠/组。***p<0.001，***p<0.0001，双向方差分析，随后进行事后Tukey多重比较测试）。D类)VTN增加FGF2，已知其可促进祖细胞形成，但不是祖细胞标记物EGFR(E类)，但在SC144存在下两者都增加，如（A-C）相同的SVZ样本所示。F类)纹状体内注射后48小时，成年C57BL/6小鼠背外侧SVZ冠状断面BrdU免疫染色的代表性图像显示，与其他组相比，VTN+SC144（VTN/SC144）组的增殖增加。LV=侧脑室，CC=胼胝体。**G公司**)SVZ中BrdU阳性细胞核的无偏体视学计数证实，联合应用SC144可使VTN诱导增殖。数据为平均值+SEM，载体组设置为100%（n=6、5、5和5只小鼠/组。*p<0.05，双向方差分析，随后进行事后Tukey多重比较测试）。**H（H）**)同一组成年C57BL/6小鼠经SVZ冠状切片DCX（红色）免疫染色的典型共焦图像。细胞核用Hoechst（蓝色）染色。我)SVZ中的细胞计数证实，VTN/SC144增加了DCX阳性神经母细胞的数量（***p<0.001，双向方差分析，随后进行事后Tukey多重比较测试）。J型)同一成年C57BL/6小鼠背外侧SVZ中DCX（红色）和BrdU（绿色）免疫染色的代表性共焦图像。**K（K）**)SVZ中BrdU-DCX联合标记细胞的量化证实，VTN/SC144增加了神经发生（***p<0.001，双向方差分析，随后进行事后Tukey多重比较测试）。

图6。 — **图6 VTN通过抑制FAK诱导CNTF、IL-6和LIF表达。**
A类)Western blot显示，3小时后，在VTN+/+野生型小鼠纹状体内注射rhVTN可降低SVZ中的pFAK（3个独立blot的代表）。B类)定量毛细管Western记录了pFAK的减少，如合成计算机生成的谱带和C类)个别小鼠的化学发光痕迹。D类)通过曲线下面积测量pFAK/α-微管蛋白比率。数据为平均值+扫描电镜，PBS设置为100%（n=4只小鼠/组。*p<0.05，学生t检验）。E类)典型的western blot显示，纹状体内注射rhVTN也会在3小时后降低C57BL/6小鼠SVZ的pFAK。注射rhVTN降低pPyk2(F类)，pILK增加(**G公司**)和降低的pERK(**H（H）**)3小时后在VTN+/+小鼠的SVZ中。**I-J公司**)典型的western blot和密度测定定量显示，VTN−/−小鼠增加了SVZ中的pFAK（n=7和5只小鼠，*p<0.05，Student’s t检验）。星形细胞特异性FAK基因缺失（FAK^{飞行/飞行}-GFAP公司^cre公司小鼠）CNTF mRNA水平增加(**K（K）**)，但不是IL-6(**L（左）**)或LIF(**M（M）**)SVZ（比较纹状体内PBS注射组）。纹状体内注射FAK抑制剂FAK14可增加对照FAK SVZ的CNTF、IL-6和LIF mRNA^{飞行/飞行}24小时后，FAK14对FAK SVZ中的CNTF（K）没有影响^{飞行/飞行}-GFAP公司^cre公司小鼠，表明其通过FAK诱导CNTF。FAK14在对照组和cre-lox小鼠（L）中诱导IL-6的程度相同，但对FAK中LIF的影响较小^{飞行/飞行}-GFAP公司^cre公司与对照小鼠相比（M）。数据为平均值+SEM，并计算为FAK的折叠变化^{飞行/飞行}小鼠PBS组平均值（n=7、8、6和4只小鼠/组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001，双向方差分析，随后进行事后Tukey多重比较测试）。N个)纹状体内注射rhVTN增加FAK SVZ CNTF mRNA^{飞行/飞行}但不是FAK^{飞行/飞行}-GFAP公司^cre公司24小时，表明其通过星形胶质细胞FAK作用诱导CNTF。纹状体内注射rhVTN诱导的IL-6O（运行）)和LIFP（P）)在对照组和cre-lox小鼠中（n=8、5、4和5只小鼠/组。*p<0.05，**p<0.01，双向方差分析，随后进行事后Tukey多重比较试验）。

图7。 — **图7 FAK的星形细胞特异性敲除增加SVZ神经发生。**
A类)成人FAK背外侧SVZ冠状面BrdU免疫染色的代表性图像^{飞行/飞行}和FAK^{飞行/飞行}-GFAP公司^cre公司每天注射3次BrdU的小鼠显示FAK SVZ的增殖增加^{飞行/飞行}-GFAP公司^cre公司老鼠。B类)SVZ中BrdU阳性核的无偏体视学计数证实了FAK^{飞行/飞行}-GFAP公司^cre公司小鼠的细胞增殖比FAK多27%^{飞行/飞行}小鼠（n=9和7只，***p<0.001，学生t检验）。C类)成人FAK背外侧SVZ中BrdU（绿色）和DCX（红色）免疫染色的代表性图像^{飞行/飞行}和FAK^{飞行/飞行}-GFAP公司^cre公司小鼠FAK SVZ的神经发生增加^{飞行/飞行}-GFAP公司^cre公司老鼠。LV=侧脑室，STR=纹状体，CC=胼胝体。D类)SVZ中BrdU-DCX联合标记细胞的定量证实了FAK^{飞行/飞行}-GFAP公司^cre公司小鼠的神经发生率是FAK的2倍^{飞行/飞行}小鼠（n=9和7只，***p<0.001，学生t检验）。

图8。 — **图8 VTN通过CNTF诱导SVZ神经发生的总结。**
VTN在毛细血管外周细胞中表达独特。释放的VTN结合星形胶质细胞上的整合素，导致FAK抑制和随后的CNTF诱导，促进SVZ中的神经发生。LIF部分增加，尽管星形胶质细胞中FAK抑制，IL-6由另一种细胞类型产生，可能是小胶质细胞。CNTF促进神经发生，而LIF和IL-6通过促进神经干细胞自我更新和/或抑制神经祖细胞的产生来抑制神经发生。

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1. Armulik A，Genove G，Betsholtz C，2011年。周细胞：发育、生理和病理的观点、问题和前景。Dev Cell第21期，193–215页。-公共医学
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[1] Aberg MA、Aberg ND、Palmer TD、Alborn AM、Carlsson-Skwirut C、Bang P、Rosengren LE、Olsson T、Gage FH、Eriksson PS，2003年。IGF-I在成年海马祖细胞中具有直接的增殖作用。分子细胞神经科学24，23–40。-公共医学

[2] Aberg MA、Aberg ND、Palmer TD、Alborn AM、Carlsson-Skwirut C、Bang P、Rosengren LE、Olsson T、Gage FH、Eriksson PS，2003年。IGF-I在成年海马祖细胞中具有直接的增殖作用。分子细胞神经科学24，23–40。-公共医学

[3] Acevedo LM、Lindquist JN、Walsh BM、Sia P、Cimadamore F、Chen C、Denzel M、Pernia CD、Ranscht B、Terskikh A、Snyder EY、Cheresh DA，2015年。人胚胎干细胞向自主神经细胞命运的分化取决于来自共同模式血管系统的不同线索。干细胞报告41075–1088。-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Acevedo LM、Lindquist JN、Walsh BM、Sia P、Cimadamore F、Chen C、Denzel M、Pernia CD、Ranscht B、Terskikh A、Snyder EY、Cheresh DA，2015年。人胚胎干细胞向自主神经细胞命运的分化取决于来自共同模式血管系统的不同线索。干细胞报告41075–1088。-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Alvarez-Buylla A，Lim DA，2004年。从长远来看：保持成人大脑中的生发龛。神经元41、683–686。-公共医学

[6] Alvarez-Buylla A，Lim DA，2004年。从长远来看：保持成人大脑中的生发龛。神经元41、683–686。-公共医学

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[8] Armulik A，Genove G，Betsholtz C，2011年。周细胞：发育、生理和病理的观点、问题和前景。Dev Cell第21期，193–215页。-公共医学

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