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.2018年10月15日：9:1332。
doi:10.3389/fphys.2018.01332。 2018年eCollection。

利用人类诱导的携带致病性的多能干细胞模拟骨骼肌层粘连LMNA公司突变

杂色B钢种马 1 2, 卢卡·平顿 1 2, Shilpita Sarcar公司 1, 塔内尔·奥兹德米尔 1 2, 萨拉·马菲奥莱蒂 1, 彼得·扎米特 2, 弗朗西斯科·萨维里奥·特德斯科 1 三
附属公司

利用携带致病基因的人诱导多能干细胞模拟骨骼肌层粘连蛋白病LMNA公司突变

杂色B钢种马等。 前生理学. .

摘要

层粘连蛋白病是一组临床异质性疾病，由LMNA公司.由编码的主要蛋白质LMNA公司是拉明A和C，与拉明B1和B2一起形成核膜：位于内核膜下方的网状结构。层粘连蛋白病表现出显著的组织特异性，亚型影响横纹肌、周围神经和脂肪组织，而其他亚型则会导致多系统疾病，加速衰老。尽管已经提出了几种致病机制，但椎板病的确切病理生理学仍不清楚，加上这些疾病的罕见性以及缺乏易于研究的细胞类型。为了克服这一局限性，我们使用来自骨骼肌层粘连病患者的诱导多能干细胞（iPSCs），例如LMNA公司-先天性肌营养不良和边缘肌营养不良1B与模型疾病表型相关在体外iPSC可以从容易获得的细胞类型中获得，具有无限的增殖潜力，并且可以分化为其他难以获得且具有侵袭性的细胞类型。来自三名骨骼肌层粘连病患者的iPSC系被分化为可诱导的肌源细胞和肌管。在这些细胞中观察到疾病相关表型，包括核形状异常和核板蛋白定位错误。在终末分化骨骼肌肌管的单层培养中，细胞核异常较增殖肌原细胞中不明显。值得注意的是LMNA公司-与跨多种致病基因的传统单层培养相比，人工肌肉中突变iPSCs构建的肌核异常检测得到了改进，为骨骼肌层粘连病提供了一个高保真的建模平台。我们的结果为未来基于iPSC的骨骼肌层粘连病治疗开发和筛选平台奠定了基础。

关键词：三维建模；LMNA；疾病建模；iPSC；层粘连蛋白A/C；椎板病；肌营养不良；骨骼肌。

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数字

图1
图1
差异化LMNA公司-突变的人iPSCs表达Lamin A/C和Lamin B1，许多具有异常的核形状。（A）三者的相位对比图像LMNA公司突变诱导的肌原细胞系K32del、R249W和L35P，在其各自的电泳图旁边，证实了预期的杂合、显性、致病性LMNA公司突变。（B）Lamin A/C和Lamin B1蛋白的代表性免疫荧光小组显示细胞核形状异常，且Lamin B1全部定位错误LMNA公司突变线（用箭头突出显示的例子）。用Hoechst对细胞核进行复染。比例尺：50μm。
图2
图2
LMNA公司-突变的人iPSC-derived诱导的成肌细胞具有形态异常的细胞核。（A）免疫荧光的代表性例子显示LMNA公司-突变HIDEM K32del、R249W和L35P（图1B中的高倍照片）。异常核形态被分为五类：果冻豆、严重变形、水疱、线状或细长，每个细胞系都显示了每种形态的示例，以及相应的核轮廓比值。具有正常形状的圆形/椭圆形细胞核的细胞通常具有1–0.79的细胞核圆形度，而细胞核畸形会降低这一比率（如每块面板所示）。拉明空调的一些定位错误也很明显（白色箭头）。比例尺：20μm。（B）核畸形LMNA公司-利用核轮廓比量化突变HIDEM。与Tukey’s的单因素协方差分析（ANOVA）事后的，事后的与每个控制线相比，对三次重复的平均值进行比较(n个=3，每个细胞系每重复传代评估152–334个细胞核）；*第页< 0.05,**第页< 0.01,***第页< 0.001,****第页< 0.0001. 数据是由三个重复组合的所有圆度值生成的方框图（每个细胞系共分析了663-755个细胞核）；胡须：最小值和最大值，+：平均值（也在每列底部指定）。（C）量化核形状异常以及正常核形状（圆形或椭圆形）的患病率。如果沿着其长轴>25μm，则认为细胞核被拉长。当出现异常时，有一种以上类型的细胞核被计数两次（例如，气泡和拉长），因此总数可能超过100%。比较两组之间正常形状细胞核的数量LMNA公司-突变HIDEM和对照1（参考1）和对照2（参考2）。每个重复的细胞系分析81到167个细胞核，而对照1的一个重复仅评估51个细胞核（每个细胞系总共评估248到355个细胞核）。对三次重复的平均值进行统计(n个=3）使用与Tukey’s的单向协方差分析（ANOVA）与每个对照品系进行比较事后的，事后的比较；*第页< 0.05,**第页< 0.01,***第页< 0.001,****第页< 0.0001.
图3
图3
共焦显微镜分析LMNA公司-突变的人iPSC-derived诱导的肌源性细胞显示Lamin A/C和Lamin B1定位错误。（A）用Hoechst核反染对拉明A/C、Emerin和拉明B1进行免疫荧光，显示K32del、R249W和L35P中的拉明A/C蛋白聚集体LMNA公司-利用共焦显微镜分析突变株系。聚集体要么是蜂窝状外观（白色闭合箭头），要么是明亮的焦点（白色开放箭头）。带有拉明A/C蜂巢/焦点的区域显示出相应的拉明B1缺失（黄色开放箭头）。在一些含有Lamin A/C病灶的区域也检测到了含Emerin的病灶（黄色闭合箭头），但带有Lamin A/C蜂巢的区域没有观察到对应的Emerin蜂巢，但Emerin免疫标记较弱，因此可能无法检测到蜂巢。比例尺代表10μm。（B）量化LMNA公司-拉明A/C定位错误的突变HIDEMLMNA公司-突变HIDEMs的Lamin A/C聚集体明显多于每个对照细胞系（参考文献1和2）（C） LMNA公司-与对照组相比，突变HIDEMs具有拉明B1覆盖的细胞核比例（细胞核两极缺失）显著升高（参考文献1和2）。（D）与对照2（参考2）相比，Emerin定位错误对K32del或L35P显著，但对对照1（参考1）则不显著。在R249W中，与对照组1和2相比，差异显著（参考文献1和2）。因此，我们总体上判断这种表型仅在R249W中是稳健的。采用单因素协方差分析（ANOVA）对Lamin A/C、Lamin B1和Emerin数据进行统计分析，Tukey's事后的，事后的比较。这项分析是根据每个细胞系三个传代的平均错误定位比例进行的(n个=3，每个细胞系每代分析82–178个细胞）；*第页< 0.05,***第页< 0.001,****第页与每个对照组相比<0.0001。数据是根据每个成像场中Lamin A/C定位错误的细胞核比例生成的方框图（每个细胞系的24–33个成像场由三个重复组合而成，总共包含290–429个细胞核）；胡须：最小值和最大值，+：所有成像场的平均值。
图4
图4
终末骨骼肌分化LMNA公司-单层培养中的突变iPSC-derived肌管以及核圆形和形状异常的分析。（A）K32del、R249W和L35P iPSCs HIDEMs上Lamin A/C和肌球蛋白重链（MyHC）的代表性免疫荧光，通过慢病毒传递的他莫昔芬诱导的MyoD-ER转基因瞬时表达诱导最终肌源性分化。可见细胞核伸长和核泡（箭头）。比例尺：100μm。（B）终末微分平均核圆度的量化LMNA公司-通过测量肌管内和肌管外细胞核的轮廓比突变iPSCs。参考=控制。数据分析采用双向重复测量方差分析，使用Tukey's事后的，事后的与对照组和Sidak的比较测试事后的，事后的在每一行内进行比较。n个=3个独立的实验重复，每个重复的细胞株分析100–270个细胞核，除了在K32del中的一个重复，在K32del中仅在肌管外发现57个细胞核。*第页< 0.05,****第页< 0.0001. 数据是方框图，包含所有三个重复组合的单个圆度值（每个细胞系总计275–715个细胞核）。晶须：最小值和最大值；+：所有值的平均值。（C）根据HIDEMs中建立的标准量化肌核形态异常的患病率（图2）。当出现异常时，对具有一种以上类型的细胞核进行两次评分（例如，气泡和拉长），因此总数超过100%。比较了正常形状的细胞核的数量LMNA公司-突变HIDEM和对照2（参考）。每个细胞系每次重复分析78至348个细胞核（每个细胞系共评估260至710个细胞核）。对三次重复的平均值进行统计(n个=3）使用与Tukey’s的单向协方差分析（ANOVA）与每个对照品系进行比较事后的，事后的比较；*第页< 0.05,***第页< 0.001.
图5
图5
LMNA公司-R249W在终末骨骼肌分化时产生Lamin A/C聚集体LMNA公司-单层培养中的突变iPSCs。（A）用Hoechst核复染法检测层粘连蛋白A/C和MyHC的免疫荧光，显示K32del、R249W和L35P中的层粘连蛋白A/C蛋白聚集体LMNA公司-共焦显微镜分析的突变肌管。聚集物外观呈蜂窝状（白色开口箭头）或明亮病灶（白色闭合箭头）。（B）尽管在所有LMNA公司-与对照组相比，突变体肌核仅R249W显著（参考文献）。与Tukey’s的单因素协方差分析（ANOVA）事后的，事后的比较，平均三段(n个=3，每个细胞系每代分析74到156个肌核）；*第页与对照肌管相比<0.05。数据以方框图的形式绘制，该方框图由每个成像场中Lamin A/C定位错误的细胞核比例生成（每个细胞系21–56个成像场由三个重复组合而成，共包含381个肌核）；胡须：最小值和最大值，+：所有成像场的平均值。比例尺：30μm。
图6
图6
异常拉长的核特征LMNA公司-突变iPSC衍生肌管在单层培养或3D人工肌肉中分化。LMNA公司-突变HIDEMs K32del、R249W和L35P要么在（A）单层培养或（B）在3D人造肌肉中。免疫标记层粘连蛋白A/C和肌源性标记胚胎肌球蛋白（eMyHC）或Titin的共聚焦成像细胞的三维计算机生成重建。箭头：核异常伸长。比例尺：20μM。
图7
图7
疾病相关的核异常在终末肌源性分化时更为常见LMNA公司-三维培养中的突变iPSCs。（A）根据二维图像分析中建立的形状异常标准，从图6所示的计算机生成的三维重建中评估异常的K32del、R249W和L35P肌管核LMNA公司-突变型HIDEM（图2）。肌核的三个统计比较如下：LMNA公司-在人工肌肉内单层培养（参考1，黑色）中控制的突变体LMNA公司-对照突变体（参考2，绿色），在2D和3D人工肌肉（蓝色）之间的每行比较中。使用双向方差分析和Tukey’s分析数据事后的，事后的与对照组的比较，以及Sidak的三段平均行内比较(n个=3，对于单层培养，每代细胞株分析82–154个肌核，每细胞株共分析272–410个，对于人工肌肉，分析37–70个细胞核，每细胞系共分析124–171个）。数据显示为所有三个重复的每个成像场中异常核比例的方框图（三个重复组合的每个细胞系22–44个总成像场）；胡须：最小值和最大值，+：所有成像场的平均值。图表上显示的值：用于统计分析的三次重复的平均值。（B–E）不同类型形状异常的量化（A），基于LMNA公司-突变HIDEM（图2）。如中所示（A），显示了三种类型的比较。对具有一种以上形状异常（如气泡和伸长）的细胞核进行了两次计数，因此总数可能超过100%。使用双向方差分析和Tukey’s分析数据事后的，事后的与对照组和Sidak的比较测试事后的，事后的行内比较测试(n个= 3).（F）沿着核主轴的肌核长度。如中所示（A），进行了三种类型的比较。使用Tukey's双向方差分析法分析数据事后的，事后的与对照组和Sidak的比较测试事后的，事后的行内比较测试(n个= 3). 数据显示为散点图，由三次重复的所有值组合而成。条形图：平均偏差和标准偏差。根据多核肌球蛋白/肌动蛋白阳性结构内的位置以及肌球蛋白和肌动蛋白的核排斥，评估细胞核是否为肌管的一部分。培养物中非肌管细胞核的数据未显示。*第页< 0.05,**第页< 0.01,***第页< 0.001,****第页< 0.0001.
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