The deubiquitinase MYSM1 dampens NOD2-mediated inflammation and tissue damage by inactivating the RIP2 complex

doi:10.1038/s41467-018-07016-0

.2018年11月7日；9(1):4654.

doi:10.1038/s41467-018-07016-0。

氘激酶MYSM1通过灭活RIP2复合物抑制NOD2介导的炎症和组织损伤

Swarupa熊猫¹, 尼尔森·O·盖卡拉²

附属公司

¹瑞典分子感染医学实验室（MIMS），乌梅大学微生物研究中心（UCMR），瑞典乌梅大学，90 187。
²瑞典分子感染医学实验室（MIMS），乌梅大学微生物研究中心（UCMR），瑞典乌梅大学，90 187。nelson.gekara@mims.um美国。

采购管理信息： 30405132
预防性维修识别码： PMC6220254型
内政部： 10.1038/s41467-018-07016-0

氘激酶MYSM1通过灭活RIP2复合物抑制NOD2介导的炎症和组织损伤

Swarupa熊猫等。国家公社. 2018.

.2018年11月7日；9(1):4654.

doi:10.1038/s41467-018-07016-0。

作者

Swarupa熊猫¹, 尼尔森·O·盖卡拉²

附属公司

¹瑞典分子感染医学实验室（MIMS），乌梅大学微生物研究中心（UCMR），瑞典乌梅大学，90 187。
²瑞典分子感染医学实验室（MIMS），乌梅大学微生物研究中心（UCMR），瑞典乌梅大学，90 187。nelson.gekara@mims.um美国。

采购管理信息： 30405132
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摘要

NOD2对抗菌天然免疫和组织稳态至关重要，但需要严格调控以避免病理。NOD2信号的一个焦点是RIP2，它在多泛素化后使NOD2:RIP2复合物成核，使信号事件导致炎症，然而，协调这一过程的多泛素的确切性质和调控尚不清楚。在这里，我们表明NOD2信号涉及RIP2与赖氨酸63（K63）、K48和M1多泛素链以及非标准K27链的偶联。此外，我们确定MYSM1是一种近端氘化酶，通过选择性地去除K63、K27和M1链，但保留K48链，减弱NOD2:RIP2复合物组装。因此，MYSM1缺陷小鼠会出现无限制的NOD2介导的腹膜炎、全身炎症和肝损伤。本研究提供了NOD2:RIP2信号传导中多泛素的完整概述，并揭示了MYSM1作为限制这些多泛素以防止过度炎症的中心负调控因子。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
NOD2信号涉及RIP2的K63-、K48-、K27-和M1-多泛素化。一通过泛素限制（UbiCRest）分析测定RIP2上的多泛素连接。用L18-MDP刺激WT BMDM 1的TUBE下拉分离泛素化蛋白 h与指示DUB孵育1 h.然后对样品进行RIP2免疫印迹。红色虚线是一条任意线，突出了Ub-RIP2从高MW到低MW中间/完全消化产物的相对转变。b条用于UbiCRest分析的DUB泛素连接特异性色码**a、 c（c）**.c（c）中描述的相应UbiCRest消化率一通过免疫印迹分析K63、K48、K27和M1键。d日在存在（+）或不存在（-）LUBAC抑制剂gliotoxin（GT）的情况下，用L18-MDP刺激WT BMDM的细胞裂解液，并用抗RIP2进行免疫沉淀。然后用免疫印迹法对所示分子进行下拉。电子不同的多泛素结合到RIP2的拟议序列的示意性总结。数据代表至少3个独立实验。另请参见补充图1和补充图2

图2
MYSM1独立于LUBAC被招募到NOD2:RIP2复合体。一骨髓基质干细胞MYSM1（绿色）在（Ctrl）前或1后的免疫荧光染色用L18-MDP刺激h。比例尺（10 微米）。b条在存在或不存在胶质毒素（GT）的情况下，用L18-MDP刺激WT BMDM指定时间的RIP2免疫沉淀物和相应的全细胞质部分对指定分子进行免疫印迹。**c（c）**用L18-MDP刺激不同时间的WT BMDM产生的HOIP、MYSM1或RIP2免疫沉淀物，以及相应的全细胞质部分，检查是否存在指示分子。数据代表三个独立实验

图3
MYSM1抑制近端NOD2信号事件和细胞因子反应。一,b条重量，*神秘1*^−/−、和*撕裂2*^−/−BMDM，未刺激（Ctrl）或用L18-MDP刺激（200 ng/ml），通过qRT-PCR分析*Tnfa公司*和*伊尔6*成绩单6 刺激后h(一)或分泌的TNF-α和IL-6 12 h刺激后(b条).c（c）,d日重量，*神秘1*^−/−、和*撕裂2*^−/−BMDM，未刺激（Ctrl）或用C12-iE DAP刺激（200 ng/ml），通过qRT-PCR分析*Tnfa公司*(**c（c）**)和*伊尔6*(d日)成绩单6 刺激后h。中的结果(一——d日)来自三个独立的实验。数据显示为平均值 ± s.e.m.公司(n个 = 3） ***第页<通过单因素方差分析确定0.001，然后通过Bonferroni的后验描述统计显著性。电子重量，*神秘1*^−/−和*撕裂2*^−/−通过免疫印迹分析MYSM1、p-RIP2、RIP2，p-TAK1、TAK1，p-IKKα/β、IKK al/β、p-p38 MAPK和p38 MAPKs，对未刺激（Ctrl）或用L18-MDP刺激指定时间的BMDM进行分析。α-微管蛋白作为负荷对照。中的数据(电子)是三个独立实验的代表

图4
MYSM1与NOD2:RIP2复合体相互作用并破坏其功能。一WT和*神秘1*^−/−用L18-MDP刺激指定时间的BMDM用抗RIP2免疫沉淀(一)或抗MYSM1(b条). 下拉菜单(**a、 b条**)和相应的细胞质或核组分(**c（c）**)对指示蛋白进行免疫印迹。d日MDP刺激前后MYSM1亚细胞定位示意图。数据代表至少三个独立实验

图5
MYSM1通过去除K63、K27、M1而不是K48多泛素来破坏NOD2:RIP2复合物。一UbiCRest分析中使用的DUBs泛素连接特异性的颜色编码(**b、 e（电子）**).b条L18-MDP刺激BMDM的TUBE下拉（1 h）进行UbiCRest，然后免疫印迹RIP2、K63、K48、K27和M1多泛素链。红色虚线是一条任意线，突出了Ub-RIP2从高MW到低MW中间/完全消化产物的相对转变。**c（c）**WT和WT的天然和变性细胞质组分*神秘1*^−/−用L18-MDP刺激指定时间的BMDM用抗RIP2免疫沉淀，并用免疫印迹法对指定分子进行下拉。d日MYSM1的泛素连锁特异性。用SDS-PAGE凝胶分离与重组MYSM1孵育的指示连接的双-双肽，并用银染法显示。电子L18-MDP刺激WT BMDM的TUBE下拉1 h与指示DUB的较高浓度孵育3 h.然后对样品进行RIP2、K63和K48 polubiquitin链的免疫印迹。红色虚线(**b、 e（电子）**)是表示消化后从高MW Ub-RIP2形态向低MW Ub-RIP2形态相对转变的任意线条。注意，对于最大Ub限制，in电子，与b条.（f）MYSM1从RIP2中去除多泛素的拟议模型示意图。数据代表了两到六个独立实验。另请参见补充图5

图6
MYSM1通过SWIRM和MPN域使RIP2复合体失活。一MYSM1结构域突变结构的示意图。b条补体中全长MYSM1（MYSM1-FL）或SWIRM+MPN的免疫荧光染色*神秘1*^−/−BMDM 1 L18-MDP刺激后h。比例尺（10 微米）。**c（c）**,d日 *神秘1*^−/−用L18-MDP刺激补充有MYSM1结构的BMDM。用抗RIP2免疫沉淀细胞质组分。下拉菜单(**c（c）**)以及相应的细胞质或核组分(d日)对指示的分子进行了分析。电子——**（f）** *神秘1*^−/−BMDM或*神秘1*^−/−用L18-MDP刺激补充有指示结构的BMDM 12 h，用ELISA分析TNF-α和IL-6分泌。中的结果电子——**（f）**来自三个独立的实验。数据显示为平均值 ± s.e.m.公司(n个 = 3） ***第页<通过单因素方差分析和Bonferroni后验确定的0.001描述了相对于Ctrl的统计显著性。另请参见补充图6和补充图7

图7
MYSM1抑制NOD2介导的全身炎症和肝损伤。一显示中性粒细胞（CD11b）募集的典型流式细胞术轮廓图⁺，RB6-8c5⁺)进入WT的腹腔（PEC）(n个 = 6）和*神秘1*^−/−(n个 = 6）小鼠6 h服用MDP后（25 mg/kg体重）或对照缓冲液（Ctrl）。**b–c类**显示PEC中性粒细胞平均百分比的相应条形图(b条)和脾脏(**c（c）**).d日——电子重量(n个 = 12),*神秘1*^−/−(n个 = 12）和*撕裂2*^−/−(n个 = 12）小鼠接种GalN（1 g/kg体重，通过腹腔注射（i.p）途径4 挑战MDP前h（25 mg/kg体重，i.p）分析6 TNF-α、IL-6治疗h后(d日)和血清中的肝丙氨酸氨基转移酶（ALT）(电子).（f）——克肿瘤坏死因子-α、白介素-6(**（f）**)和ALT(克)血清中*神秘1*^{飞行/飞行}(n个 = 8）或*神秘1*^{飞行/飞行}赖氨酸M Cre(n个 = 8） GalN和MDP激发的小鼠**d–e日**。每个数据点表示(**b至g**)一只单独的老鼠。数据显示为平均值 ± 科学与发展部****第页<0.0001通过使用Bonferroni的多重比较检验进行单因素方差分析（ANOVA）确定。中的数据b条,**c（c）**和**（f）**,克来自两个独立的实验(d日,电子)，来自三个独立的实验。面板中FAC数据的选通策略参见补充图10(一——**c（c）**)

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