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.2018年11月6日；9（6）：e02126-18。
doi:10.1128/mBio.02126-18。

细胞NMD途径限制寨卡病毒感染并以病毒衣壳蛋白为靶点

Krystal A Fontaine公司 # 1, 克里斯托弗·利昂 # 1 2, Mir M Khalid公司 1, 萨基·托马尔 1, 大卫·吉梅内兹·莫拉莱斯 1 三, 玛丽亚·邓拉普 1, 朱莉娅·凯伊 1, Priya S Shah公司 三, 史蒂夫·芬克贝纳 1 4, Nevan J Krogan先生 1 三, 梅兰妮·奥特 5 6
附属机构

细胞NMD途径限制寨卡病毒感染并以病毒衣壳蛋白为靶点

Krystal A Fontaine公司等。 mBio公司. .

摘要

寨卡病毒（ZIKV）感染神经前体细胞（NPC）子宫内与小头畸形等神经系统疾病相关，但对ZIKV诱导的发病机制缺乏详细的分子认识。这里我们展示一下在体外人类细胞（包括NPC）的ZIKV感染会导致非传感介导的mRNA衰变（NMD）通路中断。NMD是一种细胞mRNA监测机制，是小鼠正常大脑大小所必需的。利用亲和纯化质谱法，我们鉴定了与病毒衣壳蛋白结合的多种细胞NMD因子，包括中央NMD调节因子up-frameshift蛋白1（UPF1）。在共免疫沉淀实验中，内源性UPF1与ZIKV衣壳蛋白相互作用，衣壳表达在转录后下调UPF1蛋白水平，我们证实这一过程发生在ZIKV感染期间。细胞分馏研究表明，ZIKV衣壳蛋白通过蛋白酶体特异性靶向核UPF1进行降解。RNAi进一步降低UPF1水平显著增强了鼻咽癌培养物中的ZIKV感染，这与NMD限制胎儿大脑中ZIKV的感染模型一致。我们认为，ZIKV通过衣壳蛋白进化出了一种降低UPF1水平和抑制NMD抗病毒活性的策略，这反过来又有助于神经病理学体内重要性寨卡病毒（ZIKV）是一种严重的全球健康威胁，因为感染与严重的神经并发症有关，包括小头畸形。使用人类干细胞衍生的神经祖细胞模型系统，我们发现在ZIKV感染期间，一个称为非传感介导的mRNA衰变（NMD）通路的关键细胞质量控制过程被破坏。重要的是，NMD通路的中断是小头畸形和其他神经系统疾病的已知原因。我们进一步鉴定了ZIKV衣壳蛋白与NMD主调节蛋白up-frameshift蛋白1（UPF1）之间的相互作用，并表明ZIKV的衣壳靶向UPF1进行降解。总之，这些结果为ZIKV感染如何在发育中的大脑中引起神经病理学提供了一种新的机制。

关键词：寨卡病毒；非传感介导的mRNA衰变途径；病毒与宿主的相互作用。

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数字

图1
图1
ZIKV感染破坏NMD途径。（a） 来自Huh7细胞或NPC的NMD底物转录水平和看家基因控制，模拟感染或感染ZIKV菌株P6-740或当代临床分离物PRVABC59。以0.1或1的感染倍数（MOI）感染细胞，并在感染后48小时（hpi）收获细胞。数据表示为平均值加上平均值标准误差（SEM）（误差条）。统计显著性（和P（P）值）由未配对学生的t吨测试并指示如下：*，P≤ 0.05; **,P（P）≤ 0.01; ns，不显著。进行了三个独立的实验。（b） 维恩图显示与NPC的ZIKV感染和HeLa细胞中UPF1敲除（KD）相关的显著上调基因重叠。在56hpi收获的模拟感染或ZIKV感染的NPC和在转染后72小时（hpt）收获的对照siRNA处理或UPF1 siRNA处理的HeLa TO细胞的RNA-Seq分析。然后使用GeneProf超几何概率计算器生成超几何P（P）值****,P（P）≤ 0.0001. （c） 在b组中确定的看家基因和参与细胞周期阻滞和凋亡的选择基因的转录水平。Huh7细胞被模拟感染或感染ZIKV PRVABC59，MOI为0.1或1，并在48 hpi时收获。数据表示为均值加SEMP（P）值由未配对学生的t吨测试。*,P（P）≤ 0.05; **,P（P）≤ 0.01; ***,P（P）≤ 0.001; ns，不显著。n个=3个独立实验。
图2
图2
ZIKV的衣壳蛋白与NMD通路相互作用。（a） 乌干达ZIKV衣壳（Ug Cap）（MR 766）和法属波利尼西亚ZIKV衣（Fp Cap）的PPI图（H/PF/2013）显示了宿主NMD相关因子（紫色）的显著富集，如AP-MS所示（SAINTq概率得分>0.9，假发现率[FDR]<0.05）。Fp-Cap和宿主NMD因子之间的十种相互作用（超几何检验，P（P）值=7.16 × 10−10)Ug-Cap和宿主NMD因子之间的八种相互作用(P（P）值=3.45 × 10−7)已确定。（b） 用载体或标记ZIKV衣壳（H/PF/2013，亚洲血统）转染HEK293T细胞，并在48 hpt时收获以免疫沉淀内源性UPF3B的共免疫沉淀（co-IP）和Western blot分析。IP Capsid印迹中检测到的上带代表非特异性伪影。α-Flag，抗Flag抗体。（c） 用载体或标记ZIKV衣壳转染HEK293T细胞并在48 hpt下收获以免疫沉淀内源性UPF1的Co-IP和Western blot分析。（d） 对转染Strep-tagged ZIKV衣壳和Myc-UPF1（野生型）、Myc-UPF1-C126S（RNA-binding突变体）或Myc-UPF-G495R/G497E（ATP酶/解旋酶突变体）的HEK293T细胞进行Myc-tag co-IP和Western blot分析，并在48 hpt下收获以免疫沉淀ZIKV衣壳。（e） 在48 hpi收获的模拟感染和ZIKV感染（PRVABC59，MOI为1）Huh7细胞或模拟感染和ZIKV感染（P6-740，MOI为1）NPC中UPF1水平的蛋白质印迹分析，β-肌动蛋白和ZIKV包膜（ZIKV e）或ZIKV衣壳（ZIKV C）蛋白分别作为负载和感染对照。使用ImageJ进行密度分析，以量化相对带强度。数据表示为均值加SEMP（P）值由未配对学生的t吨测试**,P（P）≤ 0.01; ***,P（P）≤ 0.001.n个=3个独立实验。
图3
图3
ZIKV衣壳通过蛋白酶体依赖机制降解NMD的主调节因子UPF1。（a） Western blot分析转染载体或标记ZIKV衣壳（H/PF/2013，亚洲血统）48 H的亚细胞分离HEK293T细胞中UPF1水平。GAPDH用作细胞质标记，SP1用作核标记，以确保最佳分离。使用ImageJ进行密度分析，以量化相对带强度。数据表示为平均值加SEM。P（P）值由未配对学生的t吨测试**,P（P）≤ 0.01; ns，不显著。n个=3个独立实验。（b） Western blot分析转染载体或标记ZIKV衣壳48小时的分馏HEK293T细胞中的核UPF1水平。细胞在收获前用二甲基亚砜或增加蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Borte）浓度处理24小时。使用ImageJ进行密度分析以量化相对带强度。数据表示为平均值加SEM。P（P）通过单因素方差分析和多重比较计算值。*,P（P）≤ 0.05; ns，不显著。n个=3个独立实验。（c） 转染Strep-tagged ZIKV衣壳的Huh7-Lunet细胞细胞核的典型3D共焦显微镜图像。细胞在24 hpt时用二甲基亚砜或10 nM硼替佐米，在48 hpt下用抗Strep标签（绿松石色）和内源性UPF1（紫色）抗体进行免疫染色。DAPI（蓝色）用于染色和定义细胞核。每个通道都进行了数字重建，以实现3D共定位的可视化。确定了门限Mander相关系数P（P）值由未配对学生的t吨测试**,P（P）≤ 0.01.n个=每个条件8个细胞。比例尺代表3 微米。
图4
图4
UPF1基因敲除增强了NPC对ZIKV感染的耐受性。（a） Western blot分析96 hpt下转染非靶向siRNA（siNT）或UPF1特异性siRNA池（siUPF1）的NPC中UPF1水平。使用ImageJ进行密度分析，以量化相对带强度。数据表示为平均值加SEM。P（P）值由未配对学生的t吨测试**,P（P）≤ 0.01.n个=使用一条NPC线进行3个独立实验。（b） 以0.1或1的MOI感染ZIKV菌株PRVABC59并在48 hpi收获的siNT处理或siUPF1处理的NPC中的ZIKV RNA水平。数据表示为平均值加SEM。P（P）值通过双尾比率配对Student’st吨测试***,P（P）≤ 0.001.n个=使用一条NPC线进行3个独立实验。（c） 从48 hpi收获的siNT处理或siUPF1处理的ZIKV-infected（MOI of 1）NPC释放感染性病毒。数据表示为平均值加SEM。P（P）值由未配对学生的t吨测试**,P（P）≤ 0.01.n个=使用一条NPC线进行3个独立实验。（d） ZIKV感染、siNT治疗的鼻咽癌或ZIKV-感染、siUPF1治疗的鼻咽癌的典型共焦显微镜图像，细胞核用DAPI（蓝色）染色，ZIKV dsRNA病灶用抗dsRNA mAb J2（蓝色）着色。使用伊玛瑞斯斑点检测功能生成3D图像渲染和重建dsRNA病灶。比例尺代表2 微米。（e） 平均每个细胞的dsRNA焦点数量。数据表示为平均值加SEM。P（P）值通过双尾比率配对Student’st吨测试。ns，不显著。n个=3个独立实验，使用两个NPC细胞系，每个实验每个条件分析3到10个细胞。（f） 对每个细胞的dsRNA聚焦体积的测量值进行平均。数据表示为平均值加SEM。P（P）值通过双尾比率配对Student’st吨测试。ns，不显著。n个=3个独立实验，使用两个NPC细胞系，每个实验每个条件分析3到10个细胞。（g） 在48 hpi下测量siNT处理或siUPF1处理、ZIKV感染（MOI of 1）NPC的感染率。固定细胞接种抗DENV单克隆抗体1.6D，该单克隆抗体也能识别ZIKV包膜蛋白（56）。数据表示为平均值加SEM。P（P）值通过双尾比率配对Student’st吨测试**,P（P）≤ 0.01.n个=使用两条NPC线进行3个独立实验。（h） ZIKV衣壳蛋白与NMD通路UPF1相互作用模型。
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