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.2019年1月3日；39（2）：e00359-18。
doi:10.1128/MCB.00359-18。 2019年1月15日印刷。

衰老乳腺间质细胞通过白细胞介素-8依赖性激活基质成纤维细胞促进致癌

Huda H Al Khalaf公司 1 2, 哈泽姆·盖贝 三, 拉比亚·伊纳斯 1, 阿卜杜利拉·阿布塞克拉 4
附属机构

衰老乳腺间质细胞通过白细胞介素-8依赖性激活基质成纤维细胞促进致癌

Huda H Al-Khalaf公司等。 分子细胞生物学. .

摘要

衰老和应激促进衰老，衰老具有内在的抑癌作用和外在的促癌作用。因此，揭示衰老诱导剂对组成不同器官的各种类型细胞的影响至关重要。我们在这里表明，原代正常乳腺腔（NBL）细胞比相应的基质成纤维细胞对增殖和氧化损伤诱导的衰老更敏感。与成纤维细胞一样，衰老的NBL细胞分泌大量的各种细胞因子，包括白细胞介素-6（IL-6）和IL-8，并高水平表达p16、p21和p53，而层粘连蛋白B1下调。当衰老时，管腔细胞通过激活STAT3通路以IL-8依赖的方式激活基质成纤维细胞。这些肌成纤维细胞以旁分泌方式促进乳腺癌细胞的上皮-间充质转化和干细胞过程在体外在乳腺癌动物模型中。这些结果表明，衰老的乳腺腔细胞通过以IL-8依赖的方式激活成纤维细胞，在促进炎症/致癌微环境中发挥作用。

关键词：IL-8；乳腺癌；成纤维细胞；管腔细胞；衰老。

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数字

图1
图1
原代乳腺腔细胞和成纤维细胞的纯化和表征。（A） 使用EpCAM通过顺序门控分选的分离的乳腺管腔细胞的点图高的CD49f型+（P3），然后是EpCAM高的CD10型否定（第4页），MUC-1+（第5页），最后是CD24+（P6）亚群。最初分选的乳腺管腔细胞（第一分选）培养几天，然后使用相同的门控策略进一步分选，即表型（第二分选）。通过流式细胞仪重新分析分选细胞的纯度（第二次分选后）。这些数字表示所选选通电路中单元的百分比。（B） 利用所示抗体对原代人乳腺腔细胞进行代表性免疫荧光分析。比例尺代表50 微米。（C） 初级人类乳腺成纤维细胞的流式细胞术斑点图。数字代表CD49f的比例+EpCAM公司−细胞。
图2
图2
乳腺管腔细胞的衰老早于其对应的基质成纤维细胞。对来自同一乳腺组织的原代管腔细胞和成纤维细胞进行传代培养，然后在PD2和PD5时使用。（A） 指示细胞的SA-β-Gal和Ki-67染色。比例尺代表50 微米。（B） SA-β-Gal和Ki-67的标记指数。（C） 从所示细胞制备全细胞裂解物，并使用特定抗体通过免疫印迹法评估所示蛋白的水平。（D） 在指定时间采集细胞，用碘化丙啶染色，并用流式细胞仪分析细胞周期分布。数字表示细胞周期不同阶段的细胞比例。（E） 收集所示PDs处管腔细胞的SFCM，并将其应用于人类细胞因子抗体阵列膜。显示了一些重要的差异表达蛋白。（F） 收集用于细胞因子阵列分析的SFCM通过ELISA评估分泌的IL-8水平。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。*，P（P）=1.7815×10−5.
图3
图3
灯具细胞比成纤维细胞对基因毒性应激诱导的衰老更敏感。（A） 原代人腔细胞（NBL-10）和成纤维细胞（NBF-10）（来自同一乳房）要么接受假处理（对照），要么用H激发2O（运行）2(200 µM）24小时，然后固定并用SA-β-Gal或Ki-67染色。比例尺代表50 微米。（B） SA-β-Gal和Ki-67的标记指数。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。（C） 从按照A组所述处理的指示细胞制备全细胞裂解物，并使用针对指示蛋白质的抗体进行免疫印迹。（D） 对共培养的原代管腔细胞和成纤维细胞（分别为NBL-10和NBF-10）进行模拟治疗（对照）或用γ射线（5Gy）或H射线照射2O（运行）2(500 µM）24小时，然后固定并用SA-β-Gal染色。比例尺代表50 微米。（E） SA-β-Gal的标记指数。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。
图4
图4
衰老的乳腺管腔细胞激活乳腺基质成纤维细胞。（A） 收集来自年轻和衰老NBL-10细胞的SFCM，并将其应用于来自同一供体的NBF-10细胞上24小时，同时使用SFM作为对照。然后收集得到的成纤维细胞（分别为YLAF、SLAF和SFTC），并使用RTCA-DP-xCELLigence系统评估指示细胞的增殖率。数据代表了一式三份的不同实验。（B） 从所示细胞制备全细胞裂解物，然后用于免疫印迹分析。（C） 使用RTCA-DP-xCELLigence系统评估指示细胞的迁移和侵袭能力。数据代表了三份不同实验的数据。（D） 收集YLAF和SLAF中的SFCM，并通过ELISA评估指示的细胞因子水平。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。*,P（P） ≤ 0.000652. （E） 使用RTCA-DP-xCELLigence系统，以SFM（SFTC）作为对照，在YLAF或SLAF的SFCM存在下评估MDA-MB-21细胞的迁移和侵袭能力。数据代表了三份不同实验的数据。
图5
图5
IL-8激活乳腺基质成纤维细胞。将指数增长的NBF-10细胞暴露于含IL-8（10、25和50）的SFM或SFM中 ng/ml）或暴露于含有抗IL-8中和抗体的ILAF-SFCM或SLAF-SFCM（0.2或0.4 μg/ml）（IgG作为对照）24小时。（A）制备总RNA，并通过qRT-PCR分析指示转录物的水平。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。（B） 使用RTCA-DP-xCELLigence系统评估增殖、迁移和侵袭能力。数据代表了三份不同实验的数据。（C） 收集来自所示成纤维细胞的SFCM，并通过ELISA评估所示分泌细胞因子的水平。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。（D） 指数增长的成纤维细胞（NBF-20、-21和-34）暴露于含IL-8（25 ng/ml）处理24小时。制备全细胞裂解物并用于免疫印迹分析。（E） 收集来自所示成纤维细胞的SFCM，并通过ELISA评估所示分泌细胞因子的水平。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。（F） 用于B组的SFCM也用于治疗乳腺癌细胞（MDA-MB-231），然后使用RTCA-DP-xCELLigence系统评估其增殖、迁移和侵袭能力。数据代表了三份不同实验的数据。
图6
图6
IL-8可以穿过基底膜，激活三维培养的乳腺基质成纤维细胞。（A） NBF-10细胞在3D网络中生长，然后暴露于SFM或含有IL-8（25 随后，提取总RNA，并使用指定基因的特异引物进行qRT-PCR分析。（B） NBF-10细胞在含有网状物（基底膜模拟物）的3D培养物中生长，该网状物将含有或不含有IL-8的SLEC-SFCM或SFM中的细胞分离24小时，然后纯化RNA，并使用指示基因的引物进行qRT-PCR。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。
图7
图7
乳腺基质成纤维细胞的IL-8相关激活是STAT3依赖性的。（A） 用STAT3-siRNA（NBF10STAT3si）或对照siRNA（NBF1 0C）转染NBF-10成纤维细胞，然后用于制备全细胞裂解物，用于通过免疫印迹法评估指示蛋白的水平。（B） 从指示的成纤维细胞中制备总RNA，并通过qRT-PCR评估指示转录物的水平。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。*,P（P） ≤ 0.001. （C） 从指定的成纤维细胞中收集SFCM，并通过ELISA评估指定分泌细胞因子的水平。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。*,P（P） ≤ 0.001.
图8
图8
SLAF和ILAF促进乳腺癌细胞的EMT和干细胞在体外和体内（A）将指数生长的MDA-MB-231细胞暴露于来自指示细胞的SFCM 24 h，然后收集细胞并用于制备全细胞裂解物，以利用特定抗体通过免疫印迹评估指示蛋白的水平。（B） 通过将MDA-MB-231细胞与YLAF、SLAF或ILAF在裸鼠乳头下共注射，建立了乳腺癌原位异种移植物。（左）时间依赖性肿瘤生长（平均值±SD）；（右）56岁后肿瘤大小 注射后第天。（C） 切除含有指示细胞的肿瘤，制备全细胞裂解物，并通过使用特异性抗体的免疫印迹来评估指示蛋白的水平。（D） 使用抗CD-34或抗Ki-67抗体对含有YLAF、SLAF或ILAF的指定FFPE肿瘤进行免疫组化。比例尺代表50 微米。（E） 直方图显示了在两种不同肿瘤的五个不同区域观察到的微血管的平均数量。数据表示平均值±标准偏差。*,P（P） < 0.0000054.
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