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.2019年1月3日；39（2）：e00332-18。
doi:10.1128/MCB.00332-18。 2019年1月15日印刷。

白细胞介素-8激活乳腺癌相关脂肪细胞并促进其血管生成和肿瘤生成-促进作用

Huda H Al-Khalaf公司 1 2, Bothaina Al-Harbi公司 1, 阿德尔·赛义德 三, 玛丽亚·阿拉法 4, 阿斯玛·图尔巴 4, 阿卜杜勒·阿齐兹·贾曼 5, 法拉·阿尔·莫哈纳 6, 阿卜杜利拉·阿布塞克拉 7
附属公司

白细胞介素-8激活乳腺癌相关脂肪细胞并促进其血管生成和肿瘤生成-促进作用

Huda H Al-Khalaf公司等。 分子细胞生物学. .

摘要

越来越多的证据支持活性基质脂肪细胞在乳腺癌发展和扩散中的关键作用。然而，调解人和行动机制仍然难以捉摸。我们在这里显示，从10例浸润性乳腺癌中分离出的癌相关脂肪细胞（CAA）是促炎性的，并且表现出活跃的表型，包括与相邻肿瘤对应脂肪细胞（TCA）相比更高的增殖、侵袭和迁移能力。此外，所有CAA都分泌较高水平的白细胞介素-8（IL-8），这在介导这些细胞的旁分泌原癌作用中至关重要。重要的是，TCA细胞中IL-8的异位表达激活了它们并增强了它们的致癌作用在体外以STAT3相关方式，以及体内相反，使用特异性短发夹RNA、抗IL-8抗体或repaixin抑制IL-8信号传导抑制了CAA的活性特征，包括它们在小鼠乳腺腔细胞和原位肿瘤异种移植中的非细胞自主肿瘤促进活性。IL-8在增强乳腺脂肪细胞的促血管生成作用中也起着重要作用。这些结果明确表明，IL-8在乳腺CAAs的激活中起着关键作用，并且是其旁分泌促肿瘤效应的主要介质。因此，通过抑制IL-8途径靶向CAAs可能具有很大的治疗价值。

关键词：IL-8；STAT3；脂肪细胞；乳腺癌；修复素。

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数字

图1
图1
成熟乳腺癌相关脂肪细胞是活跃的。（A） 从所示成熟脂肪细胞制备全细胞裂解物，并利用针对所示蛋白质的抗体进行免疫印迹。（下图，左）瘦素表达水平的量化。（右）方框图显示所示类型的乳腺脂肪细胞中IL-8和NF-κB（p65）的表达水平。（B和C）从指示的脂肪细胞中制备总RNA，并用于评估CXCL8系列和RELA公司以GAPDH为参考基因，通过qRT-PCR检测mRNA。误差条表示平均值±SD，值反映三个独立的实验。如图所示，上面的面板显示了从同一患者分离的CAA细胞和TCA细胞之间单个转录物的表达差异。下部面板显示了所有CAA与相应TCA之间的差异。（D） ChIP分析。从所示脂肪细胞中纯化染色质，然后用所示抗体进行免疫沉淀。随后CXCL8系列使用特异性引物通过qPCR扩增携带NF-κB-p65结合位点的启动子。这个GAPDH公司启动子被用作非连锁位点控制，启动子的丰度相对于GAPDH公司对每个样本的输入进行归一化后。这些实验进行了三次，误差条代表平均值±SD。*,P（P） ≤ 4.1 × 10−5（E）将指示的CAA和TCA接种在CIM板上孔的SFM中，并通过RTCA-xCELLigence系统评估其迁移/入侵能力。为了进行增殖，将脂肪细胞接种在E板中的完整培养基中，并通过RTCA-xCELLigence系统评估增殖率。（F） 利用来自四种CAA亚型及其相应TCA细胞的SFCM，通过ELISA评估IL-8分泌水平。误差条代表平均值±SD；数值是通过三个不同的实验确定的。*,P（P） ≤ 0.04之间。
图1
图1
成熟乳腺癌相关脂肪细胞是活跃的。（A） 从所示成熟脂肪细胞制备全细胞裂解物，并利用针对所示蛋白质的抗体进行免疫印迹。（下面板，左侧）瘦素表达水平的量化。（右）方框图显示所示类型的乳腺脂肪细胞中IL-8和NF-κB（p65）的表达水平。（B和C）从指示的脂肪细胞中制备总RNA，并用于评估CXCL8系列和RELA公司以GAPDH为参考基因，通过qRT-PCR检测mRNA。误差条表示平均值±SD，值反映三个独立的实验。如图所示，上面的面板显示了从同一患者分离的CAA细胞和TCA细胞之间单个转录物的表达差异。下部面板显示了所有CAA与相应TCA之间的差异。（D） ChIP分析。从所示脂肪细胞中纯化染色质，然后用所示抗体进行免疫沉淀。随后CXCL8系列使用特异性引物通过qPCR扩增携带NF-κB-65结合位点的启动子。这个GAPDH公司启动子被用作非连锁位点控制，启动子的丰度相对于GAPDH公司对每个样本的输入进行归一化后。这些实验进行了三次，误差条代表平均值±SD。*,P（P） ≤ 4.1 × 10−5（E）将指示的CAA和TCA接种在CIM板上孔的SFM中，并通过RTCA-xCELLigence系统评估其迁移/入侵能力。对于增殖，将脂肪细胞接种在E板的完全培养基中，并通过RTCA-xCELLigence系统评估增殖率。（F） 利用来自四种CAA亚型及其相应TCA细胞的SFCM，通过ELISA评估IL-8分泌水平。误差条代表平均值±SD；数值是通过三个不同的实验确定的。*,P（P） ≤ 0.04.
图2
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CAAs以IL-8依赖的方式促进正常乳腺管腔细胞的EMT。将LeaL-10细胞暴露于来自四个CAA的SFM或SFCM及其四个相应的TCA细胞24小时。（A和C）评估所示对的迁移/侵袭和增殖能力。这些图表代表了不同的实验。（B和D）从所示细胞制备细胞裂解物并用于免疫印迹。（E） LeaL-10细胞在3D培养中生长，然后暴露于两种CAA及其相应的两种TCA或SFM。制备总RNA，并通过qRT-PCR评估指示转录物的水平。误差条代表平均值±标准偏差，数值来自三个不同的实验。（F） 将LeaL-10细胞作为E组、胞浆处理，并用于免疫荧光。比例尺，50 微米。（G） 将LeaL-10细胞暴露于含有抗IL-8、抗瘦素、抗IL-8+抗瘦素或抗IgG抗体的CAA1中的SFM或SFCM，然后用于评估迁移/侵袭和增殖能力。这些图表代表了不同的实验。（H） 按指示处理LeaL-10细胞，然后制备全细胞裂解物，并用于通过免疫印迹评估指示蛋白质的水平。对于免疫印迹，条带下方的数字表示相对GAPDH的相应蛋白表达水平。磷酸化蛋白的水平根据各自的非磷酸化蛋白总量进行标准化。
图2
图2
CAAs以IL-8依赖的方式促进正常乳腺管腔细胞的EMT。将LeaL-10细胞暴露于来自四个CAA及其对应的四个TCA细胞的SFM或SFCM中24小时。（A和C）评估所示对的迁移/侵袭和增殖能力。这些图表代表了不同的实验。（B和D）从所示细胞制备细胞裂解物并用于免疫印迹。（E） LeaL-10细胞在3D培养中生长，然后暴露于两种CAA及其相应的两种TCA或SFM。制备总RNA，并通过qRT-PCR评估指示转录物的水平。误差条代表平均值±标准偏差，数值来自三个不同的实验。（F） 将LeaL-10细胞作为E组、胞浆处理，并用于免疫荧光。比例尺，50 微米。（G） 将LeaL-10细胞暴露于含有抗IL-8、抗瘦素、抗IL-8+抗瘦素或抗IgG抗体的CAA1中的SFM或SFCM，然后用于评估迁移/侵袭和增殖能力。这些图表代表了不同的实验。（H） 按照指示处理LeaL-10细胞，然后制备全细胞裂解物，并通过免疫印迹法评估指示蛋白的水平。对于免疫印迹，条带下方的数字表示相对GAPDH的相应蛋白表达水平。磷酸化蛋白的水平根据各自的非磷酸化蛋白总量进行标准化。
图3
图3
IL-8上调激活乳腺基质脂肪细胞。（A） 用携带IL-8 ORF的质粒（分别为TCA1-IL8ORF和TCA3-IL8ORF）转染TCA1和TCA3细胞；以空白质粒为对照，分别为TCA1-Ctrl和TCA3-Ctrl），制备细胞裂解物并用于免疫印迹，以CAA1和CAA3为对照。（B） 从指示细胞中收集SFCM，并通过ELISA评估分泌IL-8的水平。误差条表示三个不同实验的平均值±SD。*,P（P） = 0.018. （C） 与图1F相同。（D和E）LeaL-10细胞暴露于SFM、来自TCA1-IL8ORF的SFCM或TCA1-Ctr中24小时，然后用于评估迁移/侵袭和增殖能力（D）（这些图表代表不同的实验），并制备全细胞裂解物，以通过免疫印迹（E）评估指示蛋白的水平。（F） 用STAT3 siRNA转染LeaL-10细胞，然后将其暴露于SFM、来自TCA1-IL8ORF的SFCM或TCA1-Ctrl 24小时，然后用于制备全细胞裂解物，以通过免疫印迹评估指示蛋白的水平。（G） 乳腺癌异种移植物是通过将MDA-MB-231细胞与TCA1-IL8ORF或TCA1-Ctrl细胞共注射来创建的(n个=4/每组）。（上面板）代表性肿瘤大小。（下面板）显示与时间相关的肿瘤生长的图表。误差条表示平均值±SD，数值来自四只老鼠。*,P（P）=0.014. （H） 切除肿瘤，制备全组织裂解物并用于免疫印迹。对于免疫印迹，条带下方的数字表示相对GAPDH的相应蛋白表达水平。磷酸化蛋白质的水平相对于相应的非磷酸化蛋白质的总量进行标准化。
图3
图3
IL-8上调激活乳腺基质脂肪细胞。（A） 用携带IL-8 ORF的质粒（分别为TCA1-IL8ORF和TCA3-IL8ORF）转染TCA1和TCA3细胞；以空白质粒为对照，分别为TCA1-Ctrl和TCA3-Ctrl），制备细胞裂解物并用于免疫印迹，以CAA1和CAA3为对照。（B） 从指示细胞中收集SFCM，并通过ELISA评估分泌IL-8的水平。误差条表示三个不同实验的平均值±SD。*,P（P） = 0.018. （C） 与图1F相同。（D和E）LeaL-10细胞暴露于SFM、来自TCA1-IL8ORF的SFCM或TCA1-Ctr中24小时，然后用于评估迁移/侵袭和增殖能力（D）（这些图表代表不同的实验），并制备全细胞裂解物，以通过免疫印迹（E）评估指示蛋白的水平。（F） 用STAT3 siRNA转染LeaL-10细胞，然后将其暴露于SFM、来自TCA1-IL8ORF的SFCM或TCA1-Ctrl中24 h，然后利用其制备全细胞裂解物，通过免疫印迹法评估指示蛋白的水平。（G） 乳腺癌异种移植物是通过将MDA-MB-231细胞与TCA1-IL8ORF或TCA1-Ctrl细胞共注射来创建的(n个=4/每组）。（上面板）代表性肿瘤大小。（下面板）显示与时间相关的肿瘤生长的图表。误差条表示平均值±SD，数值来自四只老鼠。*,P（P）=0.014. （H） 切除肿瘤，制备全组织裂解物并用于免疫印迹。对于免疫印迹，条带下方的数字表示相对GAPDH的相应蛋白表达水平。磷酸化蛋白质的水平相对于相应的非磷酸化蛋白质的总量进行标准化。
图4
图4
IL-8下调抑制CAA的活性特征。（A） 分别用四种不同的特异性IL-8-shRNAs（CAA1-IL8sh1、CAA1-IL 8sh2、CAA1/IL8sh3和CAA1-IL-8sh4）以及带有乱序序列的对照质粒（CAA1-Ctrl）转染CAA1细胞，然后制备细胞裂解物并用于免疫印迹。（B） 从所示细胞收集的SFCM用于通过ELISA评估分泌IL-8的水平。误差条表示平均值±SD，值表示三个独立的实验。*,P（P） ≤ 0.000246. （C） 与图1F相同。（D） 从所示细胞制备细胞裂解物并用于免疫印迹分析。对于免疫印迹，条带下方的数字表示相对GAPDH的相应蛋白表达水平。磷酸化蛋白的水平根据各自的非磷酸化蛋白总量进行标准化。（E） 将LeaL-10细胞暴露于来自所示细胞的SFM或SFCM，然后通过RTCA-xCELLigence系统评估迁移/侵袭和增殖能力。这些图表代表了不同的实验。
图5
图5
对CXCR1/2的抑制持续抑制CAA活性。（A） 用不同剂量的重组蛋白处理CAA1细胞24小时，并用抗IL-8中和抗体作为阳性对照。制备细胞裂解物，并使用特定抗体评估指示蛋白质的水平。带下方的数字表示相对GAPDH的相应蛋白质表达水平。磷酸化蛋白的水平根据各自的非磷酸化蛋白总量进行标准化。（B） 按照上述方法处理CAA1细胞，将其接种在CIM板上孔的SFM中，并评估其迁移/侵袭能力。为了进行增殖，将预处理的CAA1细胞接种在E板中的完整培养基中，并通过RTCA-xCELLigence系统评估增殖率。（C） 从指示细胞中收集SFCM（治疗24小时后[24小时]或分裂72小时后[split]），然后通过ELISA评估分泌IL-8的水平。误差条表示三个不同实验的平均值±SD。*,P（P） ≤ 0.018. （D和E）从指示的脂肪细胞中制备总RNA（分裂后72小时或第四次分裂后），然后通过qRT-PCR评估指示转录物的水平。误差条表示平均值±SD，值表示三个独立的实验。*,P（P） ≤ 0.0015. （F） 将LeaL-10细胞暴露于用repaixin或抗IL-8抗体处理的CAA1细胞的SFM或SFCM中，制备总RNA并通过qRT-PCR评估指示转录物的水平。误差条代表平均值±SD，值代表三个不同的实验。*,P（P） ≤ 0.0037.
图6
图6
CAA细胞以IL-8依赖的方式刺激小鼠乳腺癌异种移植瘤的生长。（A） 乳腺癌异种移植物是通过将MDA-MB-231细胞与CAA1-Ctrl、CAA1-IL8sh3或经repaixin（100 ng）用于24 h（CAA1-Rep）(n个=4/每组）。（上面板）代表性肿瘤大小。（下面板）时间依赖性肿瘤生长。误差条代表平均值±SD，数值来自四只老鼠。*,P（P）= 0.014. （B） 切除肿瘤，制备全组织裂解物并用于免疫印迹。带下方的数字表示相对GAPDH的相应蛋白质表达水平。
图7
图7
CAA细胞诱导血管生成体内以IL-8依赖的方式。从所示肿瘤中制备（A和D）FFPE组织，并用抗CD34抗体进行免疫组化。比例尺，50 微米。（B和E）直方图显示CD34的平均数量+在不同肿瘤的五个不同区域观察到微血管。误差条表示平均值±标准差。*,P（P） ≤ 0.0013. （C和F）与图3H和6B相同。带下方的数字表示相对GAPDH的相应蛋白质表达水平。磷酸化蛋白的水平根据各自的非磷酸化蛋白总量进行标准化。（G） 收集所示脂肪细胞中的SFM或SFCM，并将其单独添加到Matrigel（96-well板）上的HUVEC细胞上，培养5小时后评估其向毛细血管样结构的分化。图中显示了HUVEC腔的代表性照片。比例尺，30 微米。（H） 直方图显示了五个不同区域中微血管的平均数量。误差条表示平均值±SD。*,P（P） ≤ 1.19 × 10−6.
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