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.2019年3月；38(11):1905-1919.
doi:10.1038/s41388-018-0524-5。 Epub 2018年11月2日。

依赖p53的TET2自噬降解调节肿瘤治疗耐药性

张吉祥 1 2, 彭丹 三, 郭磊 1 三, 精工 4, 马晶晶 2, 贾丽 1, 李敏中 1, 邵海芳 1, 纪静 三, 加文·约翰逊 1, 孙德强 1, 曹文明 5, 罗德里克·达什伍德 1 6, 冷寒 4, 周玉斌 7 8, 魏国栋 9, 黄云（Yun Huang） 10 11
附属公司

依赖p53的TET2自噬降解调节肿瘤治疗耐药性

张吉祥等。 癌基因. 2019年3月.

摘要

p53失活的肿瘤细胞经常表现出化疗抵抗，这给癌症治疗带来了长期挑战。在这里，我们揭示了TET2在介导p53缺失诱导的结肠癌化疗耐药性中的一个先前未被认识的作用。p53全结肠癌细胞中TET2的缺失增强了DNA损伤并恢复了化疗敏感性。通过采取药物抑制和基因缺失相结合的双途径，我们发现p53通过促进其自噬降解，在蛋白质水平上破坏了TET2。在分子水平上，我们进一步揭示了TET2和p53之间的物理联系，这有助于TET2的核质穿梭以及其向自噬体募集以进行降解。我们的研究揭示了TET2和p53在抗癌治疗中的功能相互作用。我们的发现为靶向TET2以克服与突变型p53肿瘤相关的化疗耐药性奠定了基础。

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数字

图1。
图1.TET2缺失克服了p53非完整HCT116细胞的抗癌治疗耐药性。
（A） 结肠癌细胞系（HCT116、HT29和SW480）中TET2和p53蛋白的内源性水平。GAPDH被用作负荷控制。（B） （左）使用和不使用sgRNA处理WT和p53KO HCT116细胞以耗尽内源性TET2的TET2和p53蛋白表达水平。（右）FLAG-TET2过度表达的TET2KO和p53KO+TTET2KO（DKO）HCT116细胞中的FLAG-TET2和p53蛋白表达水平。（C） 细胞活力评估。WST-1用于测量在用增加剂量（0、0.4、0.8、1.6、3.2μM）的阿霉素孵育48小时后存活的HCT116细胞（WT、p53KO、TET2KO、p53KO+TTET2KO（DKO）、TET2KO+FLAG-TET2和DKO+FLAG-TET2）的百分比（n=3个独立实验）。数据显示为平均值±S.D.；*p<0.01，**p<0.001（与WT相比的双尾Student t检验）。（D） 集落形成试验，测量不同剂量（0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、3.4、3.2μM）阿霉素处理60小时后HCT 116细胞（WT、p53KO、TET2KO、p53 KO+TEM2KO（DKO）、TET2KO+FLAG-TET2、DKO+FLAG-TEM2）的存活率。（左）显示集落形成分析结果的代表性图像；（右）菌落形成的量化（n=3个独立实验）。数据显示为平均值±S.D.；*p<0.01，**p<0.001（与WT相比的双尾Student t检验）。（E） 裸鼠原位植入相应的HCT 116肿瘤细胞后，在指定时间点的肿瘤体积（左）和代表性图像（右）。n=3只小鼠/组。**p<0.001（与WT相比，双尾Student t检验）。
图2。
图2：p53在蛋白水平下调TET2，但在mRNA水平不下调。
（A） （左）对p53KO HCT 116细胞中TET2和p53蛋白水平进行Western blotting分析，包括是否再次表达FLAG标记的p53。（右）量化西区绘图结果的波段强度（n=3个独立实验）。数据显示为HEK293T细胞TET2和p53蛋白水平的平均值±S.D.（B）（左）Western-blotting分析，未转染、转染空载体（EV）或FLAG-tagged p53。（右）量化西区绘图结果的波段强度（n=3个独立实验）。数据显示为TET2 mRNA的平均值±S.D.（C）实时定量PCR分析。（n=3个独立实验）。数据显示为平均值±S.D.（双尾学生t检验）。（D） （左）Western blotting监测p53KO HCT 116细胞中TET2和p53蛋白水平，在添加剂量增加的强力霉素（0、2、4、6、8μM）后，p53可诱导表达。（右）相应实验组TET2 mRNA的实时定量PCR分析。（n=3个独立实验）。数据显示为平均值±标准差（双尾Student t检验）。（E） （左）Western blotting，用于监测指定实验组HEK293T细胞中TET2和p53蛋白水平。（右）量化西区绘图结果的波段强度（n=3个独立实验）。数据显示为所示实验组HEK293T细胞用DAPI（蓝色，细胞核）和抗TET2抗体（绿色）染色的平均值±S.D.（F）代表性共焦图像。加入多西环素诱导p53表达。EV，空载体（G）代表性斑点杂交分析结果显示了HEK293T细胞（含多西环素诱导的p53表达；顶部两个面板）或p53KO HEK293C细胞（下部两个面板。右边显示的是亚甲基蓝染色结果，以确保DNA总量相等。（H） （左）结肠癌患者肿瘤样本中p53和TET2的Western blotting分析。患者4、5和9有p53错义突变。（右）WT p53患者中标准化p53和TET2（标准化为GAPDH）蛋白水平的散点图。计算人员相关系数（r=−0.74，p=0.021）。
图3。
图3.p53和TET2蛋白水平与阿霉素抗癌治疗反应呈负相关。
（A） 增加剂量（0、0.2、0.4、1、2μM）阿霉素治疗24小时后HCT116细胞TET2和p53蛋白水平的Western blot分析TET2测试和TP53型用qPCR在用二甲基亚砜或阿霉素（0.4和2.0μM）处理24小时的HCT116细胞中测定（n=3个独立实验）。数据显示为分别暴露于3或6Gyγ射线照射6或24小时的HCT116细胞TET2、p53和γH2AX蛋白水平的平均值±S.D.（C）Western-blotting分析。（D） Western blotting分析分别用0或2.4μM阿霉素处理24小时的WT和p53KO HCT 116细胞中的TET2、p53和γH2AX蛋白水平。（E） Western blotting分析用DMSO（对照）或2.4μM阿霉素处理24小时的WT、TET2KO、p53KO和TET2KO+p53KO（DKO）细胞中的TET2、p53和γH2AX蛋白水平。
图4。
图4：p53通过自噬降解下调TET2。
（A） 对HEK293T细胞TET2、p53和LC3进行Western blotting分析，在存在相应抑制剂的情况下，强力霉素诱导p53表达。MG-132用于抑制蛋白质体降解，而3-MA、BafA1、NH4添加Cl和CQ以抑制自噬（MG-132:10μM；3-MA:10 mM；BafA1:25 nM；NH4氯：5 mM；CQ:25μM）。（B） Western-blotting监测p53诱导的HEK293T细胞中TET2、p53、Atg16L1和LC3水平，有无显示的自噬相关基因缺失。（C） TET2、p53和自噬相关蛋白（WT和p53KO HEK293T细胞在指定培养条件下的p62和LC3）的Western blotting分析（即无血清饥饿和/或用25μM氯喹（CQ）处理自噬抑制剂）。（D） 用增加剂量的雷帕霉素（0、0.2、0.4、0.8、12μg/ml）处理24小时的p53KO HEK293T细胞中内源性TET2、p62和LC3蛋白水平。添加多西环素诱导p53表达。（F） 对WT HCT 116细胞中TET2、p53、p62和LC3进行Western blotting分析，包括和不包括巴非霉素A1（BafA1）治疗（25 nM，24小时）以及阿霉素治疗24小时。添加阿霉素以诱导细胞应激和p53上调（见图3A）。
图5。
图5.TET2的自噬降解需要p53。
（A） 自然（上部）或Beclin 1基因敲除（Beclin1KO；下部）HEK293T细胞的共焦图像染色，以显示TET2（绿色）和细胞核（DAPI）。（B） 在具有和不具有FLAG标记的p53表达的WT和beclin1KO HEK293T细胞中TET2、p53、Beclin1的细胞质和细胞核部分的蛋白质印迹分析。（C） 对Beclin1 KO或becklin1KO+p53KO（DKO）HEK293T细胞中TET2、p53的细胞质（C）和细胞核（N）部分进行Western blotting分析，无论是否表达FLAG-tagged p53。（D） 共聚焦图像显示了p53诱导表达之前（上部）和之后（下部）beclin1 KO HEK293T细胞中TET2（绿色）和p62（红色）的分布。DAPI用于可视化细胞核。右侧显示TET2和p62共定位的量化（n=68）。添加多西环素诱导p53表达。（E） 共免疫沉淀（Co-IP）证实了beclin1KO HEK293T细胞中p53和TET2之间的相互作用。
图6。
图6：p53突变损害自噬介导的TET2降解。
（A） Western blotting分析p53KO HEK293T细胞中表达WT的TET2和p53突变株。已知K305A和L348A/L350A（而非R175H）会导致p53蛋白的胞质或核滞留。（B） 显示FLAG标记的p53突变体的亚细胞定位的共聚焦图像（红色）。细胞核用DAPI染色并显示为蓝色。（C） Western blotting分析p53KO HEK293T细胞中表达WT或指示的FLAG标记的p53突变体中TET2和p53的细胞质和细胞核部分。管蛋白和层粘连蛋白B1分别用于表示细胞溶质（C）和核（N）组分的分离。
图7。
图7：一个初步模型，描述了化疗（阿霉素）如何干扰p53全肿瘤细胞中TET2的p53相关自噬降解。
（左）在WT细胞中，p53通过增强TET2核出口促进TET2的自噬降解，随后向自噬体募集。维持正常细胞功能需要p53和TET2的平衡。（中）在p53 KO细胞中，在阿霉素治疗期间，p53缺失导致细胞液中TET2蛋白降解较少，但在细胞核中积聚较多。核TET2保护基因组免受阿霉素造成的DNA损伤。这最终会促进肿瘤细胞的生长和存活，从而导致化疗耐药。（右）在p53KO和TET2KO（DKO）细胞中，TET2的保护作用在化疗诱导的DNA损伤后被消除，从而克服治疗耐药性，恢复肿瘤细胞杀伤。
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