Dexamethasone-induced inhibition of miR-132 via methylation promotes TGF-β-driven progression of pancreatic cancer

doi:10.3892/ijo.2018.4616

.2019年1月；54(1):53-64.

doi:10.3892/ijo.2018.4616。 Epub 2018年11月1日。

地塞米松通过甲基化抑制miR-132促进TGF-β驱动的胰腺癌进展

附属公司

¹德国海德堡69120，海德堡大学，分子肿瘤外科，外科研究科。
²德国海德堡大学德国癌症研究中心（DKFZ）生物统计学系，邮编：69120。
^三德国海德堡69120，海德堡大学，内脏和移植外科学系。
⁴德国海德堡市海德堡大学实验骨科矫形与创伤外科，邮编：69120。

PMID： 30387838
预防性维修识别码： PMC6255064型
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地塞米松通过甲基化抑制miR-132促进TGF-β驱动的胰腺癌进展

阿里亚·阿布基万等。国际癌症杂志. 2019年1月.

.2019年1月；54(1):53-64.

doi:10.3892/ijo.2018.4616。 Epub 2018年11月1日。

附属公司

¹德国海德堡69120，海德堡大学，分子肿瘤外科，外科研究科。
²海德堡大学德国癌症研究中心生物统计学系，德国海德堡69120。
^三德国海德堡69120，海德堡大学，内脏和移植外科学系。
⁴德国海德堡市海德堡大学实验骨科矫形与创伤外科，邮编：69120。

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【勘误表】地塞米松通过甲基化诱导miR-132抑制促进TGF-β驱动的胰腺癌进展。
Abukiwan A、Nwaeburu CC、Bauer N、Zhao Z、Liu L、Gladkich J、Gross W、Benner A、Strobel O、Fellenberg J、Herr I。 Abukiwan A等人。国际癌症杂志。2023年8月；63(2):95. doi:10.3892/ijo.2023.5543。Epub 2023年7月7日。国际癌症杂志。2023 PMID：37417373 免费PMC文章。

摘要

糖皮质激素（GC），如地塞米松（DEX），因其在淋巴癌中的促凋亡作用以及与癌症生长和化疗相关的有限副作用，被作为癌症的联合治疗药物用于缓解目的。然而，有新的证据表明，GC在大多数上皮性肿瘤中诱导治疗耐药。我们最近的数据显示DEX促进胰腺导管腺癌（PDA）的进展。在本研究中，我们检测了1个原代和2个已建立的PDA细胞系，以及35个来自手术前接受（n=14）或未接受（n=21）GC的患者的PDA组织。通过microRNA微阵列分析、电子和RT‑qPCR分析，我们确定了268个microRNA在DEX处理细胞和未处理细胞之间的差异表达。以癌症进展为重点，我们选择miR‑132及其靶基因转化生长因子-β2（TGF‑β2）作为首选候选基因。miR‑132模拟直接与TGF‑β2荧光素酶构建物的3'非翻译区（3'UTR）结合并增强表达，如荧光素酶活性增加所示。相反，DEX通过启动子甲基化抑制miR‑132的表达。miR‑132模拟物还降低了体外和肿瘤异种移植中DEX诱导的克隆形成性、波形蛋白和E‑钙粘蛋白的迁移和表达。在患者中，手术前摄入GC增强了组织中TGF‑β2的整体甲基化和表达；检测到miR‑132的表达，但无法量化。我们的结果表明，DEX介导的miR‑132抑制是胰腺癌进展的关键介质，该发现为基于miRNA的治疗提供了基础。

关键词：胰腺癌；糖皮质激素；表观遗传学；microRNA信号；实验治疗。

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数字

图1
DEX下调miR-132。（A） AsPC-1细胞用1µ在30 min、24 h和96 h提取M DEX或保留为CO总RNA，并用Agilent miRNA微阵列（Release 19.0）进行分析。热图包括前24个显著差异上调和下调的miRNA。红色表示高表达，绿色表示低表达。（B）根据前三名候选人和*生物信息学*使用不同的生物信息学算法对糖皮质激素、EMT、Wnt和Smad等关键词进行分析。（C） AsPC-1细胞按指示用DEX处理或作为CO不处理，然后分离总RNA并用miR-132-3p特异性引物进行RT-qPCR分析。表达水平归一化为RNU6B。CO细胞的平均折叠变化设置为1；处理细胞中的表达水平与CO-DEX、地塞米松相关；miRNA，microRNA；上皮-间充质转化；CO，对照组/未经处理。

图2
DEX通过启动子超甲基化抑制miR-132的表达。（A） AsPC-1、PANC-1和ASAN-PaCa细胞用1µ提取基因组DNA，并使用5-mC DNA Elisa试剂盒检测5-mC水平。（B）通过IHC评估术前吸入或口服GC（+GC，n=14；吸入n=8，口服n=6）或未经GC治疗（−GC，n=18）的患者组织的代表性石蜡切片，以检测5-mC的表达。在放大×400倍的条件下，对每组10个视野中的阳性细胞数量进行量化。（C）显示了各组患者组织的代表性染色。刻度显示50µm.（D）AsPC-1和PANC-1细胞未经处理或用1µM DEX，10个µM脱甲基剂Aza，或两者兼而有之。72小时后，提取基因组DNA，然后将非甲基化细胞因子残基亚硫酸氢盐转化为尿嘧啶。用两对引物对靶向位于miR-132启动子497-540 bp的CpG岛进行PCR。第一对引物在存在甲基胞嘧啶残基（+）的情况下检测到一条120 bp的带，而第二对引物仅在存在尿嘧啶残基的情况下扩增了该区域（−）。扩增后的DNA用琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色、紫外透射和照相法显示条带。A部分和B部分的结果显示为平均值±SD。^*P<0.05。地塞米松；miR，microRNA；CO，对照组/未处理组；Aza，5′-Aza-2-脱氧胞苷；GC，糖皮质激素。

图3
miR-132与TGF-β2的3′UTR结合以抑制其表达。（A） TGF-β2 3′UTR 746-753位miR-132结合位点示意图及其与miR-132s的序列同源性。显示TGF-β2 3′UTR的突变版本。（B）将wt和mt转化生长因子-β2 3′UTR克隆到pLightSwitch中*雷尼利亚*质粒并转染到AsPC-1、PANC-1和ASAN-PaCa细胞中，存在或不存在50 nM miR-132模拟物。消极模仿作为对照。萤火虫荧光素酶共转染（0.25 ng/µl）用作标准化控制。转染后48小时*雷尼利亚*萤火虫荧光素酶是使用FLUOstar Omega微板阅读器检测的。*雷尼利亚*荧光素酶活性归一化为萤火虫荧光素酶活性。（C）用miR-132或非编码miRNA（NC）转染PANC-1细胞，或无miRNA（CO）的模拟处理。48小时后采集蛋白质并进行蛋白质印迹分析。β-actin作为正常对照。（D） IHC评估术前吸入（n=8）或口服（n=6）GC（+GC，n=14）和未摄入GC（−GC，n=20）患者的典型石蜡包埋PDA组织切片，以检测TGF-β2的表达。根据阳性细胞百分比的视觉测定，使用半定量评分系统评估表达水平。在400倍放大率下对切片进行分析，并显示代表性图像。（E）现场患者组织中miR-132表达的杂交。箭头表示阳性细胞。B部分的代表性结果显示为平均值±SD。^*P<0.05。UTR，非翻译区；wt，野生型；mt，突变/突变；miR，microRNA；CO，对照组/未处理组；GC，糖皮质激素。

图4
miR-132抑制癌症的进展特征。（A）用50 nM miR-132模拟物或阴性miR对照（NC）转染AsPC-1、PANC-1和ASAN-PaCa细胞。8小时后，用1µM DEX是否存在miR-132。48小时后，将细胞重新悬浮在完全培养基中，并在6孔组织培养板中以低克隆密度进行培养。14天后，按照材料和方法中的描述进行集落形成分析和评估。（B）如上所述转染PANC-1细胞。转染后48小时，将细胞以高密度接种在ibidi培养插入24孔板中。24小时后，一旦细胞附着并达到约90%的汇合，移除插入物以留下定义的500-µm厚划痕。在移除插入物后的24小时和48小时，立即获得无细胞间隙的图像。（C）将PANC-1细胞作为上述细胞处理，并使用RealTime-Glo™MT细胞活力测定测定细胞活力。（D）治疗24、48和72小时后，使用Coulter计数器测定PANC-1细胞的数量。数据以平均值±SD表示。^*P<0.05。地塞米松；NC，负miR控制。

图5
miR-132的过度表达可逆转EMT。（A） AsPC-1、PANC-1和ASAN-PaCa细胞转染50 nM miR-132模拟物、抗miR-13或阴性miR对照（NC），或用1µ在存在或不存在miR-132或抗-miR-132的情况下，M DEX平行或转染后8小时。48小时后，通过TaqMan miR实时qPCR检测E-cadherin和vimentin的表达，如图2D所示。（B）如上所述，转染AsPC-1细胞并用DEX处理，然后用E-cadherin和vimentin特异性抗体进行蛋白质分离和western blot分析。β-actin作为内部对照。A部分的结果显示为平均值。上皮-间充质转化；miR、微小RNA。

图6
miR-132抑制癌症特征体内（A）如图4A所示处理ASAN-PaCa细胞。48小时后，5×10⁵在胚胎发育第8天，将活细胞移植到受精鸡蛋的CAM中。10天后，切除肿瘤，用卡尺测量体积；结果在图表中显示为单点。每组的平均值以直线表示。异种移植物的代表性图像如图所示；^*P<0.05和^**P<0.01。（B）显示了每组小鸡的代表性图像和平均重量。（C）冷冻异种移植切片中人增殖标记物Ki-67的IHC染色。阳性细胞呈红-暗红色。同样，通过免疫荧光染色和DAPI（蓝色）对细胞核的复染检测TGF-β2（绿色）、E-钙粘蛋白（绿色）和波形蛋白（红色）的表达。在400倍放大下分析切片，并显示代表性图像。CAM，绒毛尿囊膜；IHC、免疫组织化学；TGF，转化生长因子。

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