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.2018年11月1日；8(1):16213.
doi:10.1038/s41598-018-34451-2。

心肌特异性条件敲除18-kDa线粒体转运蛋白对压力过载所致心力衰竭的保护作用

Phung N泰语 1, 丹尼尔·多尔蒂 2, 伯特·J·弗雷德里希 1, 西苑路 3, 邓文斌 2, 唐纳德·贝尔斯 3, 埃琳娜·德德科娃 4, 索尔·谢弗 5 6
附属公司

心肌特异性条件敲除18-kDa线粒体转运蛋白对压力过载所致心力衰竭的保护作用

Phung N泰语等。 科学代表. .

摘要

心力衰竭（HF）的特征是线粒体钙（Ca）异常2+)处理、能量衰竭和有丝分裂受损导致收缩功能障碍和心肌细胞死亡。我们之前已经证明线粒体外膜（TSPO）的18-kDa线粒体易位蛋白可以调节线粒体Ca2+吸收。本实验旨在测试TSPO在小鼠主动脉横缩（TAC）诱导的HF压力过载模型中的作用。使用Cre-loxP系统生成有条件的心脏特异性TSPO敲除（KO）小鼠。TSPO-KO和野生型（WT）小鼠接受TAC治疗8周。TAC诱导的HF显著增加WT小鼠TSPO的表达，与收缩功能、线粒体Ca显著降低相关2+摄取、复杂I活动和能量学。相反，接受TAC的TSPO-KO小鼠保持了射血分数，表现出较少的HF和纤维化临床症状。线粒体钙2+TSPO KO小鼠的摄取和能量恢复与活性氧降低、复合物I活性提高和有丝分裂保持相关。因此，HF会增加TSPO的表达，同时防止这种增加会限制HF的进展，保护ATP的生成并减少氧化应激，从而防止代谢衰竭。这些发现表明，针对TSPO的药物干预可能提供新的治疗方法来预防或治疗HF。

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数字

图1
图1
横主动脉收缩（TAC）显著增加WT小鼠TSPO的表达，这在KO模型中是有限的。(A类)用于击倒TSPO的Cre-LoxP系统图。三苯氧胺注射液激活Cre重组酶，该酶切除外显子2和3（箭头），从而使TSPO基因失活。(B类)紫外线照射下琼脂糖凝胶的代表性图像证实了液氧P插入位于TSPO两侧，WT显示935个碱基对的带，KO显示201个碱基配对的带。(C类)WT小鼠和KO小鼠均接受了横行主动脉缩窄术以诱发心力衰竭。典型的图像显示了一条正常的主动脉和一条已经结扎的主动脉。AA公司 = 升主动脉 = 横主动脉 = 降主动脉。(D类)TAC治疗一周后，在小鼠右颈总动脉（RCC）和左颈总动脉上测量多普勒血流速度，以确保收缩程度相同。典型图像显示WT TAC小鼠左右颈总动脉的流速轨迹。(E类)经TAC后，RCC和LCC的比值显示出相似的带状程度。(F类)4个实验组（来自同一凝胶）TSPO和COXIV（负载控制）的代表性蛋白质印迹图像(克)与假对照组和KO TAC组相比，WT动物中TAC组TSPO表达水平（归一化为COX IV）显著增加（n============================================================所有组均为4）。数据表示为平均值 ± 扫描电镜。‡第页 < 0.01 vs WT假手术，**p < 0.01 vs相应假手术组，##第页 < 0.01对WT TAC。
图2
图2
TSPO-KO TAC小鼠表现出缓慢的心力衰竭进展。(A类)WT-TAC小鼠和KO-TAC小鼠在1周后壁厚增加相似，但在8周时差异显著。(B类)左室舒张末期内径（LVEDD）和(C类)WT TAC小鼠左心室收缩末期内径（LVESD）显示进行性心脏扩张。(D类)代表性图像显示了所有四组心脏的m模式短轴图像。(E类)与KO-TAC小鼠相比，WT-TAC小鼠的心内膜面积显示出明显更高的心脏扩张。(F类)通过射血分数测量的收缩功能表明，WT TAC小鼠从第2周开始心脏功能较差。(克)假手术或TAC手术8周后，所有四组的典型m型胸骨旁短轴图像显示，收缩功能障碍在WT-TAC小鼠中最为明显。n个 = WT sham、KO sham，WT TAC和KO TAC分别为14、9、22和23(A类–C类和F类). 数据表示为平均值 ± 扫描电镜*p < WT TAC vs KO TAC为0.05，**p < WT TAC vs KO TAC为0.01。
图3
图3
WT-TAC小鼠出现更严重的扩张型心肌病，并表现出更严重的心力衰竭临床表现。(A类)所有四组的代表性心脏图片均显示TAC动物的心脏增大，WT TAC心脏的表型较差，包括左心房增大。(B类)心脏重量与胫骨长度比值的尸检分析表明，与假手术组或KO TAC小鼠的心脏相比，WT TAC鼠的心脏重量更大。(C类)横切面的代表性照片显示，WT TAC小鼠的心脏纤维化程度更大，定量上有一个(D类)胶原体积分数显著高于KO-TAC心脏的分数；n个 = 所有组4颗心。(E类)死后肺重量与胫骨长度的测量显示WT TAC小鼠存在肺积液。(F类)WT TAC小鼠体重明显减轻，而KO TAC鼠体重增加，这与WT TAC中更严重的HF一致。(克)心钠素（ANP）是一种典型的心力衰竭生物标志物，在WT TAC小鼠中，ANP的相对mRNA表达显著增加。(H（H）)与WT和KO shams以及TSPO-KO TAC相比，WT TAC心肌细胞的大小显著增加。n个 = 3-4颗心。数据表示为平均值 ± 扫描电镜**p < 0.01 vs相应假手术组，#第页 < 0.05 vs WT TAC，##第页 < 0.01 vs WT TAC。
图4
图4
心脏特异性TSPO沉默恢复受损线粒体Ca2+HF吸收(A类)透性化后心肌细胞负载X-Rhod-1的典型共焦图像及线粒体外Ca随后增加2+. (B类)线粒体钙的代表性追踪2+添加1.35后使用钙指示剂X-Rhod-1在渗透性心肌细胞中的摄取 µM钙2+, 2 µM钙2+、和10 µM钙2+. (C类)显示线粒体Ca的平均组数据2+四组的摄取幅度。数据表示为平均值 ± 扫描电镜（SEM.n） = 每组3个心脏，10-17个细胞*第页 < 0.05 vs相应假手术组，**p < 0.01 vs相应假手术组，##第页 < 0.01对WT TAC。(D类)[Ca升高时线粒体释放钙黄绿素测定渗透性心肌细胞中mPTP活性2+]相对长度单位从0到1.35 µM钙2+, 2 µM钙2+、和10 µM钙2在四个实验组中。摘要数据表明，所有三种钙的mPTP活性均增加2+与假手术组比较，两组患者的情况。然而，两个TAC组在所有钙水平上的mPTP活性没有显著差异2+水平。n个 = 3个心脏，10-25个细胞。数据表示为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05 vs相应假手术组，**p < 0.01与相应的假手术组相比，†第页 < 0.05 vs WT假手术。(E类)基础游离钙的测定2+在4个实验组的分离线粒体中，发现有少量增加（P < 0.05），与相应的假手术对照组相比（n===========================================================================每组6个），但WT（n = 10） 和KO TAC（n = 11，P = 0.3).
图5
图5
WT-TAC小鼠的ATP生成减少，但KO-TAC小鼠保持不变。(A类)所有4组在5种情况下归一化反向荧光强度的代表性轨迹 mM丙酮酸/谷氨酸。10 添加μM FCCP解偶联线粒体(B类)在复合物I介导的呼吸中，KO TAC心肌细胞中的ATP水平和线粒体总储备能力高于WT TAC。n个 = 3个心脏，9-14个细胞。(C类)所有4组在5种情况下归一化反向荧光强度的代表性轨迹 mM的琥珀酸甲酯。(D类)在复合物II介导的呼吸中，KO-TAC心肌细胞中的ATP水平保持不变。n个 = 3个心脏，6-8个细胞。数据表示为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05 vs相应假手术组，**p < 0.01 vs相应假手术组，†第页 < 0.05 vs WT假手术，‡第页 < 0.01 vs WT假手术，#第页 < 0.05 vs WT TAC，##第页 < 0.01 vs WT TAC。
图6
图6
WT-TAC心肌细胞活性氧生成增加，KO心肌细胞显著降低，而KO心肌线粒体氧化还原电位仍进一步降低。(A类)代表性痕迹显示FAD/FADH2电场刺激4时完整心室肌细胞的荧光强度 Hz和随后应用100 nM异丙肾上腺素，4 mM NaCN和10 μM的FCCP。4的应用 mM NaCN诱导FAD最大降低，并应用10 µM FCCP诱导FADH最大氧化2. (B类)荧光强度比表示TAC或获得电子的趋势后氧化还原电位从还原态（低比率）转移到更氧化态（高比率）。(C类)FAD/FADH的量化2日粮显示WT小鼠在异丙肾上腺素刺激后无法维持氧化还原电位。(D类)与假手术组相比，WT-TAC组的复合物I活性严重受损，但TSPO-KO-TAC组恢复。(E类)所示为0.5电场刺激结束时测得的MitoSOX红色荧光（反映线粒体超氧化物生成）的振幅 Hz和随后的100次刺激 nM异丙肾上腺素。WT-TAC心肌细胞的ROS生成增加，而KO组的ROS产生减少。(F类)显示了4个实验组的基础线粒体膜电位测量值。如图所示，WT TAC小鼠的线粒体ΔΨ严重去极化米.n个 = 3只动物，17-39个细胞。数据表示为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05 vs相应假手术组，**p < 0.01 vs相应假手术组，†第页 < 0.05 vs WT假手术，‡第页 < 0.01 vs WT假手术，#第页 < 0.05 vs WT TAC，##第页 < 0.01 vs WT TAC。
图7
图7
WT TAC心肌细胞的有丝分裂受损，KO TAC心肌病患者的有丝细胞分裂得以保留。(A类)来自所有四组的代表性心肌细胞图像显示含有mCherry-Parkin、LC3-GFP的细胞，以及两者的组合图像。(B类)定量分析（点状计数/细胞）显示WT TAC心肌细胞中m-Cherry Parkin增加，而KO TAC肌细胞中没有增加。(C类)对LC3-GFP（自噬体形成指示）的进一步定量分析表明，WT TAC心肌细胞中LC3-GFP实际上减少，而KO TAC心肌病细胞中LC3-GFP增加，这表明KO-TAC心肌细胞中线粒体自噬增加，而WT TAC-心肌细胞中没有线粒体自噬增加。(D类)所示为参与信号级联激活心肌细胞有丝分裂的蛋白质的代表性Western blot：四个实验组细胞裂解液中的PINK-1、SQSTM1/p62、TOMM22和LC3-I/LC3-II。肌动蛋白染色用于验证每个实验组的蛋白质载量相等。(E类)PINK-1蛋白表达的定量标准化为WT假手术水平，取100%。(F类)SQSTM1/p62蛋白表达的量化标准化为WT假手术水平，取100%。(克)TOMM22蛋白表达的量化标准化为WT假手术水平，取100%。(H（H）)SQSTM1/p62蛋白表达的量化标准化为WT假手术水平，取100%。(我)LC3-I蛋白表达的量化标准化为WT假手术水平，取100%。(J型)将LC3-I转化为LC3-II蛋白表达的量化标准化为WT假手术水平，取100%。n个 = 共聚焦显微镜实验中每组使用3-5只动物，8-15个细胞。数据表示为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05 vs相应假手术组，**p < 0.01 vs相应假手术组，†第页 < 0.05 vs WT假手术，‡第页 < 0.01 vs WT假手术，#第页 < 0.05 vs WT TAC，##第页 < 0.01 vs WT TAC。
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