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.2018年12月;13(12):2827-2843。
doi:10.1038/s41596-018-0066-x。

用于研究中枢神经系统治疗药物渗透性的血脑载体类有机物

附属公司

用于研究中枢神经系统治疗药物渗透性的血脑载体类有机物

索尼娅·伯格曼等。 Nat协议. 2018年12月.

摘要

血脑屏障(BBB)的体外模型是研究BBB转运和开发可到达CNS的药物的关键工具。培养的脑内皮细胞常被用来模拟血脑屏障;然而,维持可重复的血脑屏障特性和功能是一项挑战。”BBB类有机物是在低粘附条件下内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞共培养后获得的。这些有机物再现了血脑屏障的许多特征,包括紧密连接、分子转运体和药物外排泵的表达,因此可用于模拟药物在血脑屏障上的转运。本协议全面描述了培养和维护BBB类有机物所需的技术。我们还描述了两种可用于分析药物渗透到类有机物的单独检测方法:共焦荧光显微镜和质谱成像。使用我们的方案,可以在2-3天内建立BBB类有机物。需要额外的一天来分析药物渗透性。BBB类有机物平台代表了一种准确、通用和成本效益高的体外工具。它可以很容易地扩展到高通量格式,为BBB建模提供了一个工具,可以加速各种神经病理学治疗的治疗发现。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益声明作者声明,他们没有相互竞争的经济利益。

数字

图1|
图1|。用于建立BBB类有机物的每种细胞类型的特征。
a) 荧光图像显示CD31(Abcam,稀释:1:100)和VE-Cadherin(细胞信号技术,稀释:1-100)(内皮细胞标记物)在原代人脑微血管内皮细胞(HBMEC)(ScienceCell)中的表达。b) (上)亮场图像显示永生化人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3)(雪松)的形态,(中)荧光图像显示CD31的表达。c) (上图)主要人脑血管周细胞(ScienceCell)的亮场图像和(中间)显示周细胞标记NG2表达的荧光图像(Millipore,稀释度:1:100)。d) (顶部)原代星形胶质细胞(Lonza)的亮场图像和(中间)显示星形胶质细胞标记GFAP表达的荧光图像(Sigma-Aldrich,稀释度:1:100)。(b-d,底部面板)仅与次级IgG孵育的细胞(无初级IgG)用作阴性对照。细胞核用赫斯特染料(蓝色)染色。使用二级抗体抗兔Alexa Fluor 546(红色)或抗鼠Alexa Fluor 488(绿色)。比例尺:100μm(明场:20倍物镜;共焦:40倍物镜)。
图2|
图2|。BBB类有机物的培养、收集和评估。
a) 通过在BBB工作介质中共同培养hCMEC/D3(雪松)、周细胞(ScienceCell)和星形胶质细胞(Lonza),在96 well板中形成多细胞BBB类有机物。如图1所示,在共培养之前,通过免疫荧光染色对每种细胞类型的样品进行验证。微孔涂有1%(w/v)琼脂糖,形成凹形低附着表面。类有机物聚集在每个孔的中心(蓝色箭头)。b) 代表性亮场图像,根据其物理外观显示可接受和不可接受的有机物示例。在我们的实验中,在总共1056个类器官中,950个被认为是可接受的,产生了90%的平均成功率(细胞数来自11个独立的类器官培养物)。比例尺:100μm(10倍物镜)。c) 有机物(用青色箭头表示)收集在BBB工作介质中的微型离心机(0.2 mL PCR)管中。(d) 荧光图像显示有机物表面上紧密连接标记(ZO-1;红色)(Life Technologies,稀释度:1:100)的表达。(e) 荧光图像显示P-糖蛋白(P-gp;红色)外排泵(Abcam,稀释度:1:100)在类器官表面的表达。类有机物的细胞核用赫斯特染料(蓝色)染色。作为阴性对照,有机物仅用二级抗体抗兔Alexa Fluor 546(红色)或抗鼠Alexa Fluor 488(绿色)染色(无一级抗体)。比例尺:50μm(40倍物镜)。
图3|
图3|。BBB类有机物中平均荧光强度的量化。
a) BBB类有机物(深度在56-96μm之间)的共焦荧光z堆叠图像,显示已知BBB可渗透化合物angiopep-2的积累,(5μM浓度,在37°C下培养5小时)。距类有机物表面50μm的核心区域(蓝色虚线圆圈)被定义为感兴趣区域。通过测量这些光学截面核心区域内的总MFI来确定化合物的渗透率。b) 有机物的正交视图(来自面板a),显示待量化的核心区域(蓝色虚线)。在z方向内,在距离表面56μm深度至96μm深度(黄色虚线和箭头)处进行量化。比例尺:100μm(20倍物镜)。
图4|
图4|。使用BBB有机物平台通过共焦显微镜分析血管肽-2的通透性。
a) 共聚焦荧光z堆叠图像显示罗丹明标记的血管肽-2(2711.6 Da)、罗丹明填塞肽(2711.6Da),右旋糖酐-罗丹明(4400 Da)和未结合罗丹明染料(380.8 Da)进入BBB类有机物。使用hCMEC/D3、周细胞和星形胶质细胞建立类器官,然后与每种化合物(10μM浓度)在37°C下孵育5小时。通过共聚焦荧光显微镜(使用20倍物镜)对每种类器官进行成像,并使用ImageJ对类器官核心中的平均荧光强度进行量化。b) 显示化合物分布的类有机物的正交视图。白色虚线表示类器官边界。比例尺:100μm。c) 显示光学截面总平均荧光强度量化的条形图(来自a))。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验进行统计分析。图中显示了56–96μm深度光学截面核心区域的平均荧光强度之和,并带有标准偏差误差条(****p<0.0001;***p<0.001;n类有机物=5)。d) 描述Bip(1)在孵育2小时后以浓度依赖的方式转运的图表(n球体= 5–7). e) 26小时内(10μM浓度)Cy5-Bip(1)转运至BBB类有机物的时间过程分析(n球体= 4–6). 图中显示了在距每个球体表面88μm深度处用SD误差条量化的平均Cy5.5荧光强度。
图5|
图5|。通过MALDI-MS I建立和分析BKM120和达布雷尼的渗透率。
a) BBB类有机物切片用低温恒温器的设置。在PCR管底部收集有机物,并在干冰/乙醇浴中快速冷冻。然后将管盖安装到样本盘上。b) 使用电压表测量了铟锡氧化物(ITO)涂层玻片两侧的电导率,以确定用于组织切片安装的正确ITO涂层侧。ITO涂层在滑板表面产生了可测量的电阻,而未涂层的一侧是非导电的。对于MSI,冷冻切片组织必须安装在ITO涂层侧。c) 每组冷冻切片的H&E染色图像证实了BBB类器官组织的存在(n类器官= 150). 序列段用于MSI。”扫描图像用于识别ITO载玻片上类器官切片的位置像素图像显示了所选扫描区域内的像素分布(空间分辨率为30μm)。MALDI MSI离子图像显示了两种药物在类器官切片中的分布/水平,显示了类器官内BKM120的高水平积累(绿色m/z 411.1751±0.001)。在类有机物中未检测到达布拉芬尼(m/z 520.1083±0.001)。BKM图像的比例尺:100μm,Dabrafenib图像的比标尺:200μm。来自面板(c)的图像改编自Cho等人,《自然通信》(2017).

类似文章

引用人

工具书类

    1. DiLuca M&Olesen J脑部疾病的代价:是负担还是挑战?《神经元》821205-1208(2014)。-公共医学
    1. Gooch CL、Pracht E&Borenstein AR《美国神经疾病的负担:总结报告和行动呼吁》。安。神经。第81479–484页(2017年)。-公共医学
    1. Abbott NJ,Rönnbäck L&Hansson E血脑屏障处的Astrocyte-endothelial相互作用。神经科学自然评论。7, 41–53 (2006).-公共医学
    1. Banks WA从血脑屏障到血脑界面:中枢神经系统药物输送的新机会。Nat.Rev.药物发现。15, 275–292 (2016).-公共医学
    1. Cho C-F血脑屏障:脑癌治疗撞上了墙。昂科尔。时代40,1(2018)。

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