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.2018年10月26日；19（11）：3345。
doi:10.3390/ijms19113345。

外源性Cripto-1抑制肿瘤干细胞模型的自我更新

Jahangir Alam先生 1 2, 高桥良田 三, 所说的M Afify 4 5, 昂哥哥乌 6, Kazuki Kumon公司 7, 亨德·纳瓦拉 8, Aprilliana Cahya Khayrani公司 9, 杜鹃（Juan Du） 10, 马拉姆·H·扎哈 11, 阿基马萨·塞诺 12 13, 大卫·S·所罗门 14, Masaharu Seno公司 15 16
附属公司

外源性Cripto-1抑制肿瘤干细胞模型的自我更新

Jahangir Alam先生等。 国际分子科学杂志. .

摘要

Cripto-1是表皮生长因子（EGF）-Cripto-1-FRL1-密码子（CFC）家族的一种糖磷脂酰肌醇（GPI）锚定的信号蛋白，在早期发育阶段和不同类型的癌细胞、上皮-间质转化和肿瘤血管生成中发挥重要作用。此前，我们通过在Lewis肺癌（LLC）细胞条件培养基中培养小鼠iPSCs的肿瘤干细胞（miPS-LLCcm）四周。通过定量逆转录聚合酶链反应（rt-qPCR）证实Nodal和Cripto-1在miPS-LLCcm细胞中表达，这意味着Cr-1在维持干细胞中是必需的。为了研究向肿瘤干细胞中添加外源性可溶性CR-1的生物学效应，我们制备了一种C末端截短的可溶性重组人CR-1蛋白（rhsfCR-1），其中GPI锚定部分通过定点突变取代终止密码子而去除。rhsfCR-1通过抑制Nodal-Cripto-1/ALK4/Smad2信号通路，在0-5µg/mL范围内以剂量依赖性方式有效抑制miPS-LLCcm细胞的增殖和成球能力。rhsfCR-1以1µg/mL的浓度将成球细胞的频率从1/40降至1/69。此外，在0至1µg/mL的范围内，rhsfCR-2也限制了miPS-LLCcm细胞向血管内皮细胞的分化，这可能是因为抑制了自我更新，这将减少具有干细胞特性的细胞数量。正如本研究中外源性Cripto-1的可溶性形式所证明的那样，有效的阻断将是研究Cripto-1-依赖性癌症干细胞特性用于治疗应用的一种有吸引力的方法。

关键词：克里普托-1；肿瘤干细胞；miPS-LLCcm；小鼠iPS；重组Cripto-1；自我更新。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
miPSCs、Lewis肺癌（LLC）和miPS-LLCcm细胞中Cr-1及其相关分子mRNA的表达。rt-qPCR用于评估Cripto-1、Nodal、ACVR2B、ALK4和GRP78在这三种细胞系中的相对表达。GAPDH被用作内源性对照，每个垂直条代表三个数据点的平均值±SD。经Student评估，miPS细胞和miPS-LLCcm细胞的相对表达差异具有统计学意义t吨-测试(*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001).
图2
图2
rhsfCR-1对miPS-LLCcm细胞生长抑制的评估。(A类)miPS-LLCcm细胞在有/无rhsfCR-1（1µg/mL）的情况下处理48 h，并在粘附状态下拍照；(B)用不同浓度的rhsfCR-1处理24 h后，采用MTT法评估miPS-LLCcm的存活率。实验重复三次，数据绘制为平均值±SD(n个= 3); (C类)用0.5μg/mL和1μg/mL rhsfCR-1处理24小时后，对活细胞进行计数；(D类)rhsfCR-1不诱导miPS LLCcm细胞凋亡。流式细胞术检测rhsfCR-1治疗24h后细胞凋亡情况，PI和APC-Annexin-V双重染色；(E类)在有/无rhsfCR-1的处理之间，凋亡细胞的数量没有发现显著变化。条形图表示(D类)；(F类)rhsfCR-1对miPS-LLC细胞的细胞周期无影响。用PI染色和流式细胞仪分析rhsfCR-1处理前后的细胞；(G公司)抗Ki-67抗体与GFP和DAPI染色对miPS-LLCcm细胞免疫染色的共聚焦观察；(H（H）)rt-qPCR分析经/不经rhsfCR-1处理的miPS-LLCcm细胞p21的表达；(我)rhsfCR-1在48小时内抑制miPS-LLCcm细胞的生长。使用/不使用rhsfCR-2处理24和48小时后，对活细胞进行计数。每个条形代表三个独立板的平均值±SD。带两两多重比较的单向方差分析(C类)，学生的t吨-测试(H（H）)和双向方差分析(我)用于分析显著性水平(**第页< 0.01, ***第页< 0.001).
图2
图2
rhsfCR-1对miPS-LLCcm细胞生长抑制的评估。(A类)miPS-LLCcm细胞在有/无rhsfCR-1（1µg/mL）的情况下处理48 h，并在粘附状态下拍照；(B)用不同浓度的rhsfCR-1处理24 h后，采用MTT法评估miPS-LLCcm的存活率。实验重复三次，数据绘制为平均值±SD(n个= 3); (C类)用0.5μg/mL和1μg/mL rhsfCR-1处理24小时后，对活细胞进行计数；(D类)rhsfCR-1未诱导miPS-LLCcm细胞凋亡。流式细胞术检测rhsfCR-1治疗24h后细胞凋亡情况，PI和APC-Annexin-V双重染色；(E类)在有/无rhsfCR-1的处理之间，凋亡细胞的数量没有发现显著变化。条形图表示(D类)；(F类)rhsfCR-1对miPS-LLC细胞的细胞周期无影响。用/不用rhsfCR-1处理的细胞用PI染色并通过流式细胞术分析；(G公司)抗Ki-67抗体与GFP和DAPI染色对miPS-LLCcm细胞免疫染色的共聚焦观察；(H（H）)rt-qPCR分析经/不经rhsfCR-1处理的miPS-LLCcm细胞p21的表达；(我)rhsfCR-1在48小时内抑制miPS-LLCcm细胞的生长。使用/不使用rhsfCR-2处理24和48小时后，对活细胞进行计数。每个条形代表三个独立板的平均值±SD。带两两多重比较的单向方差分析(C类)，学生的t吨-测试(H（H）)和双向方差分析(我)用于分析显著性水平(**第页< 0.01, ***第页< 0.001).
图3
图3
rhsfCR-1减弱miPS-LLCcm细胞的成球能力。(A类)在非粘附状态下，用不同浓度的rhsfCR-1处理1周后，计算球体数量。学生t吨-进行测试以分析显著性(*第页< 0.05, ***第页< 0.001); (B)在补充有ITS-x的无血清miPS培养基中的非粘附培养物中的球体，在使用/不使用rhsfCR-1（1µg/mL）处理1周后，使用球体形成分析拍摄球体；(C类)极限稀释试验对极限稀释球体形成潜力的评估表明，在96 well低连接板中，在高细胞密度/孔的条件下，在rhsfCR-1的存在下，miPS-LLCcm细胞的球体形成显著减少。（见第4节材料和方法）。
图4
图4
rhsfCR-1抑制miPS LLCcm细胞中Smad2磷酸化。(A类)用1µg/mL rhsfCR-1在无血清中处理5分钟和15分钟，通过Western印迹法评估miPS-LLCcm细胞中Smad2的磷酸化。以β-肌动蛋白为对照。显示代表性印迹；(B)使用ImageJ软件对三个不同实验中Western Blots中Smad2各条带归一化的Smad2磷酸化条带的相对强度进行了密度分析。
图5
图5
rhsfCR-1利用CD31抑制内皮细胞分化+miPS-LLCcm细胞的表型和管形成。(A类)通过rt-qPCR分析miPS-LLCcm细胞中CD31的相对表达。GAPDH的表达水平作为内源性控制。每个图表示三个数据点的平均值±SD。带两两多重比较的单向方差分析(**第页< 0.01, ***第页< 0.001); (B)Western blotting分析显示CD31蛋白减少。β-肌动蛋白作为对照；(C类)粘附条件下免疫荧光法检测miPS-LLCcm细胞中的CD31。CD31用抗兔CD31染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染；(D类)在没有和存在rhsfCR-1的情况下，CD31阳性细胞与GFP阳性细胞的比率。学生t吨-测试用于分析显著性(*第页< 0.05) (E类)在没有或存在rhsfCR-1（1µg/mL）的情况下评估miPS-LLCcm细胞的试管形成。
图6
图6
粘附培养miPS-LLCcm细胞中干细胞标记物Nanog、Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的表达评估(A类)用rhsfCR-1处理24小时后，在非粘附状态下放置在球体中(B)通过rt-qPCR检测用rhsfCR-1处理的miPS LLCcm细胞。GAPDH被用作内源性控制，每一条代表三个数据点的平均值±SD。双向方差分析(A类)通过多次比较和Student’st吨-测试(B)进行了显著性水平分析(*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; ns，不显著）。
图7
图7
rhsfCR-1抑制miPS-LLCcm细胞的迁移和侵袭。(A类)在不使用或使用rhsfCR-1（1µg/mL）治疗24和48小时后，评估伤口愈合潜力；(B)用Matrigel涂层插入物评估侵入能力。侵袭细胞用Giemsa染色；(C类)图中显示了Giemsa染色的侵袭细胞的定量分析结果。从几个不同的（六个）区域计算染色细胞的数量。使用双尾Student’s对数据进行分析t吨-测试和表示为平均值±SD***第页< 0.001.
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