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.2019年2月；37(2):226-239.
doi:10.1002/stem.2936。 Epub 2018年11月17日。

通过ESM1信号增强诱导的多能干细胞衍生内皮细胞的功能

马尔塔·维拉-冈萨雷斯 1, 索菲亚·凯莱尼 1, 科里·马吉 1, 雷切尔·凯恩斯 1, 大卫·坎贝尔 1, 马格达里尼Eleftheriadou 1, 艾米·科克伦 1, 戴安娜·德雷默 1, 玛丽安娜·齐法基 1, 卡拉·奥尼尔 1, 埃多尔多·佩德里尼 1, 杨春波 1, Reinhold麦地那 1, 丹尼斯·麦克唐纳 1, 大卫·辛普森 1, 安娜·赞佩塔基 2, 曾玲芳 2, 大卫·格里夫 1, 诺埃米·洛伊斯 1, 艾伦·W·斯蒂特 1, 安德里亚娜·玛格丽蒂 1
附属机构

通过ESM1信号增强诱导的多能干细胞衍生内皮细胞的功能

玛尔塔·维拉-冈萨雷斯等。 干细胞. 2019年2月.

摘要

心血管疾病的死亡率是世界上最高的疾病之一，因此健康的功能性内皮细胞对血管疾病至关重要。在本研究中，从健康献血者的1 ml血液中重新编程人诱导多能干细胞（iPS），然后分化为具有典型EC特征的内皮细胞（iPS-EC）。这项研究结合了iPS细胞技术和下一代测序，以深入了解iPS-EC的转录调控。我们确定内皮细胞特异性分子1（ESM1）是EC分化过程中表达最高的基因之一，通过调节连接蛋白40（CX40）和eNOS在EC富集和功能中发挥关键作用。重要的是，ESM1增强了iPS-EC在体内血管生成和后肢缺血模型中改善血管生成和新生血管的潜力。这些发现首次证明，丰富的功能性内皮细胞是通过细胞重编程和ESM1信号传导获得的，为血管疾病的药物筛选和细胞治疗开辟了前景。因此，本研究展示了一种通过ESM1信号从极少量血液中富集和增强诱导多能干细胞衍生内皮细胞功能的新方法，这大大增强了其功能并增加了其治疗潜力。干细胞2019；37:226-239.

关键词：ESM1；内皮细胞；诱导多能干细胞；重新编程；血管疾病。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人表示没有潜在的利益冲突。

数字

图1
图1
在9天内从外周血单个核细胞高效生成无整合诱导多能干细胞（iPS）。（A） ：描绘从1毫升血液样本到iPS细胞和iPS内皮细胞（EC）的流动示意图。（B） ：相位对比图显示iPS细胞集落的典型外观。多能性标记物Oct4、TRA‐1‐60、Lin28和CDy1的免疫荧光分析。细胞核用DAPI复染。比例尺为100μm，左侧图像除外，左侧图像为200μm。（C） 以下为：实时PCR显示单核细胞（MNC）和iPS细胞中Oct4、Lin28和Nanog的mRNA表达水平。将数据归一化为GAPDH（数据为平均值±SEM[n个= 3]; **,第页<.01；***，第页< .001).（D） ：Western blot显示TRA‐1‐60、Oct4和Lin28蛋白在MNC和iPS细胞中的表达。GAPDH被用作负荷控制，以校正蛋白质负荷。（E） ：皮下注射到严重联合免疫缺陷小鼠后体内iPS细胞相关畸胎瘤形成的苏木精和伊红（H&E）染色。所提供的数据是三个独立实验的代表性或平均值（±SEM）。
图2
图2
人诱导多能干细胞（iPS）向iPS内皮细胞（EC）的分化。（A） ：描述将iPS细胞区分为iPS‐EC的协议的示意图。（B） ：相位对比成像显示iPS‐EC的特征形态。比例尺=200μm。（C） 以下为：实时PCR显示内皮标记物KDR、CD144和eNOS的mRNA表达水平在CD144选择后第0天至第6天和第3天内皮分化期间iPS‐EC中的变化（数据为平均值±SEM[n个= 3]; *,第页< .05; ***,第页< .001).（D） ：流式细胞术分析显示选择前表达CD144的细胞与同型对照染色的细胞的百分比。（E） ：Western blot显示分化后iPS细胞和iPS‐EC中CD144和Oct4的蛋白表达以及CD144+选择。（F） ：CD144（左上）、CD31（右上）和ZO‐1（左中）的免疫荧光染色。连接标记被染成绿色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。图像描述了iPS‐ECs乙酰化（ac）‐LDL摄取（红色；右中）、Matrigel体外试管形成分析（左下）和CD144（绿色）体外毛细血管样结构免疫荧光染色（右下）的功能质量。细胞核用DAPI（蓝色）复染。除底部图像外，比例尺均为50μm，底部图像为200μm。（G） 以下为：iPS细胞、iPS‐EC和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的总体基因表达谱的比较：热图（曼哈顿距离，单链）显示了iPS细胞，iPS-EC和HUVECs复制品的层次聚类结果。归一化表达值用于层次聚类。在该热图中，红色表示在给定细胞系中表达更高的基因，而蓝色表示在定义细胞系中低水平表达的基因。（A） （B）和（C）指的是组重复。（H） ：iPS细胞与iPS‐EC差异表达基因的火山图，将统计显著性描述为log10(第页‐值）年轴相对于折叠变化绘制为log2（折叠变化）x个‐轴。iPS‐EC中表达更高的基因绘制在图的右侧。所提供的数据是三个独立实验的代表性或平均值（±SEM）。
图3
图3
ESM1通过诱导多能干细胞（iPS）和ESM1信号调节内皮细胞（EC）标记物的表达。（A） ：实时PCR数据显示iPS细胞、iPS‐EC（在EC分化的3、6和9天）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）之间ESM1 mRNA表达水平的比较；数据为平均值±SEM[n个= 3]; *,第页< .05; **,第页< .01).（B） ：免疫荧光图像显示ESM1（红色）、EC标记物KDR、eNOS、CD144（绿色）和DAPI（蓝色）共染。比例尺为50μm。（C） 以下为：用相应质粒转染48小时后，过度表达EX-mCherry（红色）和EX-ESM1（红色）的iPS-EC的代表性免疫荧光图像。比例尺为100μm。（D） ：ESM1过度表达48小时后，EC标记物KDR、CD144和eNOS的mRNA表达显著增加（数据为平均值±SEM[n个= 3]; **,第页< .01; ***,第页< .001).（E） ：与对照组相比，细胞培养液中ESM1过度表达48小时后的ESM1蛋白浓度水平显著增加，如Luminex分析所检测到的（数据为平均值±SEM[n个= 3]; *,第页< .05).（F） ：慢病毒转导shESM1 72小时后ESM1被敲除，与非靶向对照（shNT）相比，ESM1和EC标记物KDR、CD144和eNOS的mRNA水平显著降低（数据为平均值±SEM[n个= 3]; **,第页< .01; ***,第页< .001).（G） ：正如Luminex检测到的那样，细胞培养液中ESM1敲除72小时后的ESM1蛋白浓度水平与对照组相比显著降低（数据为平均值±SEM[n个= 3]; *,第页< .05).（H） 以下为：Western blot（左侧面板）和相应的密度测定（右侧面板）显示ESM1敲除的iPS‐EC中ESM1和eNOS的蛋白质水平降低。所提供的数据是三个独立实验的代表性或平均值（±SEM）（数据是平均值±SEM[n个= 3]; *,第页< .05; **,第页< .01).
图4
图4
ESM1调节CX40的表达。（A） ：诱导过表达ESM1（EX-ESM1）的多能干内皮细胞（iPS-EC）与对照iPS-EC（EX-mCherry）之间RNA水平差异的热图。（B） ：与对照组（EX‐mCherry；数据为平均值±SEM[n个= 3]; *,第页<.05；**，第页< .01).（C） 以下为：与非靶向对照组（shNT；数据为平均值±SEM[n个= 3]; **,第页< .01; ***,第页< .001).（D） ：蛋白质印迹显示ESM1过度表达48小时后，ESM1、eNOS、CX40和NFKB中的蛋白质水平增加。（E） ：与ESM1（红色）、CX40（绿色）和DAPI（蓝色）共染色的细胞的免疫荧光图像。比例尺为50μm。所提供的数据是三个独立实验的代表性或平均值（±SEM）。
图5
图5
ESM1通过CX40调节内皮细胞（EC）标记物的表达。慢病毒敲除诱导多能干细胞（iPS）中CX40（shCX40）72小时后，ECs、CX40、eNOS和CD144在mRNA水平显著降低，但ESM1没有显著降低（数据为平均值±SEM[n个= 3]; ***,第页< .001).（B、C）：CX40在EC分化第3天被shRNA敲除，ESM1在第4天过度表达。（B） 实时PCR数据和（C）Western blot显示ESM1介导的EC标记的诱导被CX40敲除（数据为平均值±SEM[n个= 3]; *,第页< .05; ***,第页< .001).（D） ：在ESM1过度表达前用NFKB抑制剂处理细胞：在NFKB抑制后，清除由ESM1介导的CX40、CD144和eNOS表达（数据为平均值±SEM[n个= 3]; *,第页<.05；***，第页< .001).（E） ：ESM1过度表达前用NFKB抑制剂处理的细胞中CX40报告子的荧光素酶分析（数据为平均值±SEM[n个= 3]; *,第页< .05).（F） ：免疫荧光共聚焦图像显示过度表达eNOS‐GFP的细胞中CX40（红色）、eNOS（绿色）和DAPI（蓝色）的共染色。比例尺：25μm。（G） ：co-IP显示CX40和eNOS‐GFP交互。所提供的数据是三个独立实验的代表性或平均值（±SEM）。
图6
图6
ESM1在体内改善血管生成和CD144的表达。转染后48小时，在SCID小鼠皮下注射人诱导多能干内皮细胞（iPS‐EC），其中mCherry（EX‐mCherri）或ESM1（EX­ESM1）过度表达。（A） ：EX-mCherry和EX-ESM1 Matrigel插头的H&E染色。与观察到较少血管结构的对照组织相比，EX‐ESM1组织在7天时显著形成明确的血管结构。（B） ：定量毛细管密度（数据为平均值±SEM[n个= 3]; **,第页< .01). 从10个随机微观场在×40，比例尺：50μm处进行量化）。定量毛细管密度表示为每毫米毛细管数2.（C） 以下为：CD144免疫荧光染色石蜡切片证实体内血管管中存在分化细胞。（D） ：基于双染色CD144和mCherry细胞的定量毛细血管密度（数据为平均值±SEM[n个= 3]; **,第页< .01). 从10个随机微观场在×40处进行量化（比例尺：50μm）。定量毛细管密度表示为每毫米毛细管数2。所提供的数据是三个独立实验的代表性或平均值（±SEM）。
图7
图7
ESM1显著改善了后肢缺血模型中的新生血管和血流（BF）恢复。（A） ：采用对照诱导的多能干内皮细胞（iPS‐EC；磷酸盐缓冲液（PBS）‐CTL或过度表达EX‐mCherry的iPS‐ECs）和过度表达ESM1（EX‐ESM1）治疗后，俯卧位控制小鼠下肢BF的激光多普勒图像。（B） ：每种情况下缺血足的BF恢复（以缺血足BF和对侧足之间的百分比比率计算）。统计分析显示，与对照组相比，EX‐ESM1小鼠在14天时的BF恢复显著提高；Bonferroni后验（单向方差分析）证实14天后对照组iPS‐EC和EX‐ESM1之间存在显著差异（数据为平均值±SEM[n个= 3]; *,第页< .05).（C） 以下为：用CD144抗体对每种情况的内收肌切片进行染色（左、中标尺为50μm，右标尺为100μm），并对毛细血管密度进行量化，以每毫米毛细血管数表示2.（D） ：数据为平均值±SEM(n个= 3); *,第页< .05.（E） ：CD144和mCherry双染细胞的定量毛细血管密度（数据为平均值±SEM；n个= 3; **,第页< .01). 从10个随机微观场在×40下进行量化。所提供的数据是三个独立实验的代表性或平均值（±SEM）。
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