Deoxycholate Fractionation of Fibronectin (FN) and Biotinylation Assay to Measure Recycled FN Fibrils in Epithelial Cells

doi:10.21769/BioProtoc.2972

.2018年8月20日；8（16）：e2972。

doi:10.21769/BioProtoc.2972。

纤维连接蛋白（FN）的脱氧胆酸分级和生物素化测定法测定上皮细胞中回收的FN纤维

Archana Varadaraj公司¹, 卡琳娜·马格达莱诺¹, Karthikeyan Mythrey公司^2 3

附属公司

¹美国弗拉格斯塔夫北亚利桑那大学化学与生物化学系。
²美国哥伦比亚南卡罗来纳大学化学与生物化学系。
³美国哥伦比亚南卡罗来纳大学药物化学和生物化学系。

PMID： 30370316
预防性维修识别码：项目经理6200405
内政部： 10.21769/生物协议2972

纤维连接蛋白（FN）的脱氧胆酸分级和生物素化测定法测定上皮细胞中回收的FN纤维

Archana Varadaraj公司等。生物协议. 2018.

.2018年8月20日；8（16）：e2972。

doi:10.21769/生物原型2972。

作者

Archana Varadaraj公司¹, 卡琳娜·马格达莱诺¹, Karthikeyan Mythrey公司^2 3

附属公司

¹美国弗拉格斯塔夫北亚利桑那大学化学和生物化学系。
²美国哥伦比亚南卡罗来纳大学化学与生物化学系。
³美国哥伦比亚南卡罗来纳大学药物化学和生物化学系。

PMID： 30370316
预防性维修识别码：项目经理6200405
内政部： 10.21769/生物协议2972

摘要

纤维结合蛋白（FN）是一种由多种细胞类型分泌的细胞外基质蛋白，主要与细胞表面受体整合素α5β1结合。整合素α5β1结合启动FN逐步组装成纤维，这一过程称为纤维生成。我们和其他一些人已经证明了纤维生成对细胞迁移和转移的关键作用。虽然免疫染色和显微镜方法有助于观察FN并入纤维的情况，每个纤维的长度至少为3μm，但Jean Schwarzbauer的小组于1996年发表了第一项研究，该研究开发了一种生物化学分离FN以量化并入纤维的FN的方法。我们的方案改编自原始出版物，并已在多种细胞类型上进行了测试，包括此处显示的MCF10A乳腺上皮细胞和Caki-1肾癌上皮细胞。使用两种洗涤剂提取物，将细胞FN分离为洗涤剂不溶性或纤维结合FN和可溶性FN或未结合部分。为了确定纤维生成是否利用回收的FN池，我们使用了生物素标记的FN（FN-Biotin）回收试验，该试验是根据之前的研究修改的。结合循环试验和脱氧胆酸分级方法，可以定量地显示不同实验条件下细胞内纤维生成的程度，并确定纤维生成的FN来源。

关键词：细胞内吞；细胞外基质；纤维生成；纤维结合蛋白（FN）；回收。

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利益冲突声明

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数字

图2。 — **图2纤维结合蛋白的分离和免疫印迹分析。**
为了可视化和量化可溶性和颗粒FN，负载1/10^第个如（a）所示，将Caki-1细胞的可溶部分和整个颗粒部分置于5%SDS-PAGE凝胶上。250 kDa MW阶梯上方的频带为FN。UN、1、2和3指的是“未经治疗”和三种不同的治疗条件（B）。为了使蛋白质负荷正常化，负荷1/10^第个可溶性FN的10%SDS-PAGE凝胶和GAPDH免疫印迹。蛋白质条带的像素强度使用LI-COR Lite软件通过在条带周围绘制矩形（蓝色方框）来量化。较低的值表示背景校正的波段强度，较高的值表示本底。

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