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.2018年10月27日；10(10):2991-3004.
doi:10.18632/aging.101609。

Sirt1/Nrf2通路通过调节细胞周期蛋白B1参与卵母细胞衰老

马如军（Rujun Ma） # 1, 魏亮 # 2, 秦荪 # 1, 邱旭华 1, 英林 1, 谢戈 1, Kadiliya Jueraitetibaike公司 1, 谢敏（音） 1, 冀州 1, 轩黄 1, 王强（Qiang Wang） 三, 李晨 1
附属机构

Sirt1/Nrf2通路通过调节细胞周期蛋白B1参与卵母细胞衰老

马如军（Rujun Ma）等。 老龄化（纽约州奥尔巴尼市）. .

摘要

核因子红系2相关因子2（Nrf2）能够诱导多种生物效应，Nrf2信号通路的调节与寿命密切相关。为了了解核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）是否参与卵母细胞老化，从而可能导致女性生育力下降，我们采用了一系列生物学方法，包括卵母细胞采集和培养、微量注射、RNA干扰、western blotting、免疫荧光和共聚焦显微镜，和定量实时PCR。我们的数据表明，Nrf2缺失通过抑制细胞周期蛋白B1的表达，干扰卵母细胞成熟和纺锤体/染色体组织。Sirtuin 1（Sirt1）缺失降低了Nrf2的表达，这表明小鼠卵母细胞中存在Sirt1-Nrf2-Cyclin B1信号通路。此外，免疫印迹结果表明，老龄小鼠卵母细胞中的Nrf2蛋白水平较低，母亲年龄相关的减数分裂缺陷可以通过Nrf2的过度表达得到改善，这支持了Nrf2降低是导致卵母细胞年龄依赖性缺陷的重要因素的假设。此外，我们发现Nrf2的表达与女性卵巢颗粒细胞的年龄有关，这表明Nrf2表达的减少可能与老年女性生殖能力的下降有关。

关键词：Nrf2；Sirt1；卵母细胞衰老；卵母细胞减数分裂；主轴组织。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
老年小鼠卵母细胞中的Nrf2下降。Western blot分析显示，与年轻对照组相比，老年雌性小鼠卵母细胞中的Nrf2表达降低。Actin始终充当加载控制。使用ImageJ软件计算带强度，归一化Nrf2/Actin表达的比率并显示值。数据表示为平均值±标准偏差，*与对照组相比，P<0.05。
图2
图2
卵母细胞减数分裂过程中Nrf2的细胞分布。(A类)免疫荧光染色显示Nrf2的亚细胞定位。绿色，Nrf2；蓝色，染色质。每组共检测30个卵母细胞。比例尺，20μm。(B类)免疫荧光染色用于小鼠卵母细胞中α-微管蛋白与Nrf2的共同定位。这显示了Nrf2与纺锤体在小鼠卵母细胞中的共同定位。红色，Nrf2；绿色，微管蛋白；蓝色，染色质。比例尺，20μm。
图3
图3
Nrf2基因敲除对卵母细胞成熟的影响注射Nrf2-siRNA的成熟卵母细胞在GV期用米力农滞留20小时，然后在无米力农培养基中培养以评估成熟进程。注射阴性对照siRNA作为对照。(A类)Western blot分析显示注射siRNA后Nrf2表达降低。(B类)免疫染色显示注射siRNA后卵母细胞中Nrf2丢失。比例尺，20μm。(C类)通过RT-qPCR测定对照组和Nrf2-siRNA注射卵母细胞中Nrf2、Nrf1和Keep1的相对mRNA水平。对照卵母细胞的mRNA水平设为1。(D类)对照组和Nrf2-siRNA卵母细胞GVBD率和Pb1挤出率的定量分析。数据表示为平均值±标准偏差，*与对照组相比，P<0.05。
图4
图4
Nrf2敲低对小鼠卵母细胞纺锤体结构、染色体排列、细胞周期蛋白B1和CDK1水平的影响。(A类)收集对照组和Nrf2-KD卵母细胞，并进行染色，以观察纺锤体（绿色）和染色体（蓝色）。比例尺，20μm。(B类)带有纺锤体缺陷或染色体错位的对照和Nrf2-KD卵母细胞的定量。(C类)用RT-qPCR法测定对照组和Nrf2-siRNA注射卵母细胞中细胞周期蛋白B1和CDK1的相对mRNA水平。对照卵母细胞的mRNA水平设为1。(D类)Western blot分析显示Nrf2 siRNA注射后细胞周期蛋白B1表达降低。(E类)Nrf2-KD卵母细胞CDK1蛋白水平降低。数据表示为平均值±SD，*与对照组相比，P<0.05。
图5
图5
Sirt1缺失降低卵母细胞中Nrf2的表达。(A类)用Nrf2抗体（红色）和Sirt1抗体（绿色）对GV卵母细胞进行双重染色，用Hoechst 33342（蓝色）对染色体进行反染色，确定Sirt1与Nrf2的共定位。(B类)对照组和Sirt1-KD卵母细胞用抗Sirt1抗体（绿色）和Nrf2抗体（红色）双重染色，染色体（蓝色）复染。(C类)通过RT-qPCR测定对照组和Sirt1-siRNA注射卵母细胞中Sirt1、Nrf2、Cyclin B1和CDK1的相对mRNA水平。对照卵母细胞的mRNA水平设为1。(D类)western blot分析证实注射Sirt1-siRNA后Sirt1水平降低。Actin充当加载控件。使用ImageJ计算带强度。条形图表示平均值±标准差。*与对照组相比，P<0.05。(E类-克)Western blot分析显示，Sirt1敲除后，以肌动蛋白作为负荷控制，卵母细胞中的Nrf2、Cyclin B1和CDK1蛋白水平降低。条形代表平均值±SD。*与对照组相比，P<0.05。
图6
图6
Nrf2过度表达抑制了母亲年龄相关的卵母细胞纺锤体和染色体异常。(A类)将PBS（对照组）或Nrf2质粒（过表达组）微量注射到旧的GV卵母细胞中，用米力农将卵母细胞阻滞20小时，以合成新的Nrf2蛋白。结果表明，Nrf2蛋白被有效地过度表达。(B类)注入PBS或Nrf2质粒的年轻卵母细胞、老卵母细胞和老卵母公司MII期减数分裂纺锤体和染色体的典型例子。箭头表示染色体错位。(C类)指定卵母细胞纺锤体/染色体缺陷的发生率。数据表示为3个独立实验的平均±SD百分比，其中分析了100个卵母细胞，*与对照组相比P<0.05。
图7
图7
颗粒细胞中Nrf2与年龄的相关性。(A类)用RT-qPCR法测定对照组和老年颗粒细胞中Nrf2的相对mRNA水平。将对照颗粒细胞中的mRNA水平设置为1。数据表示为平均值±SD(B类)采用RT-qPCR方法检测年轻（22-35岁）和老年（36-49岁）卵巢颗粒细胞中Nrf2的相对mRNA水平。数据表示为平均值±标准偏差，*与年轻组相比，P<0.05。(C类)人卵巢颗粒细胞中Nrf2表达与年龄的相关性分析。R=-0.5972。
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