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.2018年10月26日；12（10）：e0006873。
doi:10.1371/journal.pntd.0006873。 eCollection 2018年10月。

GSK343体外抑制曼氏血吸虫组蛋白甲基转移酶EZH2减少产卵，并降低DNA复制和非编码RNA代谢相关基因的表达

阿德里亚娜·萨·佩雷拉 1 2, 穆里洛·阿马拉尔 1, 埃尔顿·J·R·瓦斯康塞洛斯 1 2, 大卫·S·皮雷 1, 胡玛·阿西夫 1, 卢卡斯·达席尔瓦 1 2, 大卫·A·莫拉莱斯·维森特 1 2, 维托尔·卡内罗 三, 克劳迪娅·安吉丽 4, 米萨诺 4, 马塞洛·R·范塔比 三, 雷蒙德·皮尔斯 5, 乔·塞图巴尔 2, 塞尔吉奥·维尔乔夫斯基-阿尔梅达 1 2
附属公司

GSK343体外抑制曼氏血吸虫组蛋白甲基转移酶EZH2减少产卵，并降低DNA复制和非编码RNA代谢相关基因的表达

阿德里亚娜·萨·佩雷拉等。 PLoS Negl Trop Dis网站. .

摘要

背景：出现耐吡喹酮血吸虫寄生虫的可能性以及缺乏其他有效药物，需要发现新的血吸虫杀灭剂。在这种背景下，针对组蛋白修饰酶的化合物的研究是非常有希望的。我们的目的是研究抑制组蛋白甲基转移酶EZH2（一种参与染色质重塑过程和基因表达控制的组蛋白甲基化转移酶）的作用；我们使用人类细胞中EZH2的选择性抑制剂GKS343测试了曼氏血吸虫的不同发育形式。

方法/主要发现：在体外用不同浓度的GSK343处理成年雄性和雌性蠕虫以及血吸虫长达两天。Western blotting显示H3K27me3组蛋白标记在所有三种发育形式中均降低。活动性、死亡率、配对和产卵被用作成虫的杀血吸虫参数。用碘化丙啶染色和ATP定量评估血吸虫存活率。当暴露于GSK343时，成虫表现出运动性下降。此外，与对照组（0.1%二甲基亚砜）相比，GSK343处理的雌鼠产卵量减少了约40%。扫描电子显微镜显示，GSK343处理的成虫背部区域形成隆起和气泡。血吸虫的身体极度收缩，出现无数褶皱，生长速度明显减慢。应用RNA-seq来鉴定受GSK343亚致死剂量影响的代谢途径。GSK343处理的成虫表现出与跨膜转运、细胞内环境稳定和卵发育相关的基因表达显著改变。在雌性中，与DNA复制和非编码RNA代谢过程相关的基因被下调。血吸虫表现出与细胞粘附和膜合成途径相关的基因表达改变。

结论/意义：结果表明，GSK343具有体外抗曼氏血吸虫的活性，而EZH2作为一个新的潜在分子靶点的特性确定了EZH2-抑制剂是一类有前景的新化合物的一部分，可用于开发血吸虫药物。

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利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。体外GSK343对小鼠运动、配对、存活率和超微结构的影响S公司.曼索尼成虫。
（A）不同浓度的GSK343和对照（0.1%二甲基亚砜）处理的成虫在3到48小时的不同暴露时间的相对运动率。三个实验的平均值±SD，每个实验有10个蠕虫对。（B）监测对照组和治疗组在3至48小时的不同暴露时间内与不同浓度的GSK343配对。三个实验的平均值±SD，每个实验有10个蠕虫对。（C）使用发光分析法，通过寄生虫中可用的ATP总量来评估存活率。成对成虫在不同浓度的GSK343或载体（0.1%二甲基亚砜）中处理48小时。活性表示为相对于对照（DMSO）的发光值的%。三个重复实验的平均值±SD，每个实验有10个蠕虫对。对于面板（A）,（B）和（C）：与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。（D）暴露48小时至20μM GSK343的蠕虫扫描电子显微镜（注意尺寸条显示在每张图像下方的黑色细线内）；面板1和2：雄性和雌性对照组（Bar=500μm；200μm）呈现完全配对的夫妇；面板3和4：男性呈现被膜的内侧背侧区域没有结构改变（Bar=100μm；10μm）；面板5：男性后部无形态学改变（Bar=50μm）。面板6和7：用GSK343及其前部区域治疗的成虫（Bar=500μm；100μm）；面板8和9：经GSK343治疗的成虫背部区域放大图，显示结节周围的皮被损伤；面板10：经GSK343（Bar=100μm）处理的雄性成虫后部。（f）:女性；操作系统:口腔吸盘；与:腹吸盘；b条,气泡；结核:结节；拉:病变面积.
图2
图2。的背表面受损S公司.曼索尼成年雌性蠕虫暴露于20μM GSK343 24和48小时。
寄生虫扫描电镜；请注意，大小条显示在每个图像下方的黑色细线中。（A、B和C）雌性对照蠕虫背部区域的图像，与二甲基亚砜（0.1%）孵育24小时，没有结构变化（Bar=30μm；10μm和10μm）。；（D）与载体孵育24小时的雌性对照蠕虫的前部区域（Bar=50μm）；（E、F和G）用GSK343孵育24小时的雌性大鼠的背部中部出现明显的膜表面损伤，皮层中有几个水泡（Bar=20μm；20μm和5μm）；（H）经GSK343处理24小时的雌性蠕虫前部，未发生结构改变（Bar=50μm）；（I、J和K）雌性对照蠕虫的背部区域，与二甲基亚砜（0.1%）孵育48小时，呈现出完整的皮层，没有变化（Bar=50μm；5μm和2μm）；（左）用0.1%二甲基亚砜孵育48小时后，雌性对照蠕虫的前部区域没有任何变化。（巴=50μm）；（M、N和O）用GSK343孵育48小时的雌性大鼠背部中部区域，显示皮盖剥落并出现水泡（Bar=50μm；10μm和5μm）；（P）经GSK343处理48小时的雌性蠕虫的前部出现表皮和腹吸盘的剥落（Bar=50μm）。操作系统:口腔吸盘；与:腹吸盘；b条:水泡；第页:剥皮.
图3
图3。卵子大小和产卵量减少S公司.曼索尼雌性大鼠暴露于20μM GSK343 24或48小时。
鸡蛋的扫描电子显微镜；请注意，大小条显示在每个图像下方的黑色细线中。（A）未接触该化合物（0.1%二甲基亚砜）的对照雌性卵子的显微照片；面板1和3：卵圆形，脊柱侧位正常(秒)24和48小时（Bar=40μm）；面板2和4：孵育24小时和48小时时，卵表面显示正常的微针状体（Bar=2μm）。接触GSK343（20μM）的雌性卵子显微照片；面板5和7：卵子尺寸减小，脊椎外侧(秒)处理24和48小时时（Bar=40μm）；面板6和8：卵表面在24和48小时时出现裂缝（Bar=2μm；3μm）。(B和C）的总面积尺寸S公司.曼索尼分别用GSK343（20μM）或载体（0.1%二甲基亚砜）孵育的雌鼠释放的卵和卵数。***p<0.001。
图4
图4。大鼠背部表面的主要超微结构变化S公司.曼索尼幼虫暴露于不同浓度的GSK343 48小时。
（A）幼虫寄生虫的扫描电镜观察；请注意，大小条显示在每个图像下方的黑色细线中。（面板1）对照幼虫（0.1%二甲基亚砜）的低倍图像（Bar=100μm）；（面板2和3）未发生结构改变的对照幼虫的口腔和腹部吸盘（Bar=30μm和20μm）；（面板4和5）对照幼虫的内侧背部区域显示完整的皮层（Bar=20μm和5μm）；（面板6）20μM GSK343（Bar=100μM）处理的幼虫低倍图像；（面板7和8）用20μM GSK343处理的幼虫口腔和腹侧吸盘的未检测到的变化（Bar=40μM和30μM）；（面板9和10）幼年蠕虫的内侧背侧区域显示扩大的视图，显示皮盖上的水疱和病灶（Bar=10μm和5μm）；（面板11）经50μM GSK343处理的幼虫低倍图像显示形态改变（Bar=200μM）；（面板12和13）经50μM GSK343处理的幼虫口腔和腹部吸盘呈现开裂区域（Bar=40μM和30μM）；（面板14和15）用50μM GSK343处理的幼虫的内侧背部区域显示出皮层的侵蚀（Bar=10μM和5μM）。操作系统:口腔吸盘；与:腹吸盘；b条:水泡.（B）使用发光分析法，通过寄生虫中可用的ATP总量来评估幼虫的生存能力。用不同浓度的GSK343或载体（0.1%二甲基亚砜）处理幼虫24小时（黑色条）和48小时（灰色条）。活性表示为相对于对照（DMSO）的发光值的%。三个重复实验的平均值±SD，每个重复实验有10条幼虫*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5
图5。20μM GSK343暴露后血吸虫的形态学变化和凋亡增加。
（A）血吸虫扫描电镜观察；请注意，大小条显示在每个图像下方的黑色细线中。（A，面板1和2）显示腹吸盘的相同放大倍数（Bar=40μm）的血吸虫对照显微照片(与)典型血吸虫在培养基中保存16小时（第1组）或在培养基+载体（0.1%二甲基亚砜）中进一步培养24小时（第2组）；侧方和腹侧形态正常，血吸虫在含载体培养基中孵育24h后发育和延长正常（对比图2和图1）。（A，面板3）第2组对照血吸虫的高倍放大显示，整个身体表面被脊椎覆盖，没有超微结构变化（Bar=3μm）；（A，面板4和5）与对照组2相比，对照血吸虫在含车培养基中培养更长时间（48 h），显示出进一步的发育和生长（第4组，Bar=50μm）；并且更高的放大倍数（图5，Bar=3μm）证实，表面被脊椎覆盖，没有超微结构变化。（A，面板6和7）血吸虫腹部吸盘的相同放大倍数（Bar=30μm）显微照片(与)典型血吸虫在培养基中保存16小时（第6组）或在培养基加20μM GSK343中再培养24小时（第7组）；在GSK343存在下24小时后，血吸虫没有表现出明显的发育或大小变化，身体区域极度收缩，出现大量褶皱和小水泡（图7）。（A，面板8）面板7中血吸虫的高倍放大是一个例子，表明暴露于20μM GSK343 24小时的寄生虫体表有高度变化，包括剥落和水泡形成（Bar=3μM）。（A，面板9和10）与最初的血吸虫相比，血吸虫在培养基加20μM GSK343中孵育的时间更长（48小时），没有进一步发育（第9组），与第7组相比，水泡数量更多；图10显示了图9中血吸虫的更高放大倍数，表皮严重剥落，许多脊椎消失（Bar=5μm）。(B）血吸虫与载体（0.1%二甲基亚砜）或20μM GSK343孵育24和48小时的总长度。三个重复实验的平均值±SD，每个重复实验有20个血吸虫。(C）用20μM GSK343处理48小时后，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性增加。三个重复实验的平均值±SD，每个重复实验有20000个血吸虫。（D，面板1至4）用0.1%二甲基亚砜或20μM GSK343孵育72小时的血吸虫TUNEL分析（面板1和2）。绿色寄生虫表示DNA断裂。在面板1中，对照寄生虫（0.1%二甲基亚砜）的DAPI核DNA染色。在面板2中，对面板1中的对照寄生虫进行TUNEL染色（0.1%二甲基亚砜）。在第3组中，GSK343处理的寄生虫的DAPI核DNA染色。在第4组中，GSK343的TUNEL染色处理了第3组中的寄生虫。(与)，腹吸盘；(s），棘；(b条)，水泡***p<0.001。
图6
图6。定量研究不同浓度和孵育时间下GSK343处理引起的血吸虫存活率下降。
（A）用指示浓度的GSK343或载体（0.1%二甲基亚砜）处理血吸虫24、48和72小时，用碘化丙啶（死亡细胞标记；572 nm发射滤镜）和荧光素二乙酸酯（活细胞标记；492 nm发射滤镜）染色。最下面一行显示阳性对照，即接触70%乙醇，可杀死所有寄生虫。对于每个时间点（如顶部所示），左图显示了光学显微镜图像，右图显示了通过叠加536nm和494nm的落射荧光光谱对PI阳性的死亡血吸虫和FDA阳性的活血吸虫进行差分荧光检测的同一区域的图像。（B）治疗血吸虫存活率的定量。治疗三天内活血吸虫（未用碘化丙啶染色）的百分比。对于每种测试条件，使用了大约3600只血吸虫，分为四个生物复制品和三个时间点进行分析。四个重复实验的平均值±SD。（C）使用发光分析评估GSK343暴露下血吸虫存活率的ATP定量。血吸虫（100-120/孔）与指示浓度的GSK343或载体（0.1%二甲基亚砜）孵育5天。活性表示为相对于对照（DMSO）的发光值的%。三个重复实验的平均值±SD*p＜0.05**p<0.01（双向方差分析）。
图7
图7。组蛋白H3翻译后修饰剖面S公司.曼索尼用GSK343治疗后。
成虫体内五种不同的组蛋白标记（A至E）和血吸虫（F至J）通过western blotting检测和定量（A和F）抗H3K27me3，（B和G）抗H3K9ac，（C和H）抗H3K27ac，（D和I）抗H3K4me3，（E和J）抗H3K27me1抗体。每个面板由两部分组成：上部显示未经处理的对照寄生虫（C）或用20μM GSK343（T）处理48小时的寄生虫的核提取物的典型西方印迹的车道，这些寄生虫是用针对所示组蛋白标记的特异抗体或抗H3抗体开发的，用作样本加载规范化器。分子量标记蛋白（MW，15 kDa）被指出。每个面板的下半部分显示了三个生物复制品带的平均强度，通过提取扫描图像的强度值获得；对于每个样品，组蛋白H3的强度将修饰组蛋白带的强度归一化。显示平均值±标准差；采用t检验，得出具有统计学意义的p值：*p<0.05**p<0.01。
图8
图8。RNA-seq检测成人差异表达基因的热图S公司.曼索尼GSK343处理的雌雄蠕虫。
热图显示了雌性的三个生物复制（列）中差异表达基因（系）的层次聚类（A）和雄性（B）成虫样本，用于对照或治疗寄生虫，如热图顶部所示。寄生虫暴露48小时在体外至车辆（控制）或至20μM GSK343。基因表达水平通过RNA-seq测量，并以Z分数表示，Z分数是低于（蓝色，下调）或高于（红色，上调）每个基因治疗和对照样品平均表达值的标准偏差数；表达水平的Z分数是按照底部刻度所示的颜色编码的。
图9
图9。用RNA-seq检测GSK343处理血吸虫中差异表达基因的热图。
热图显示了血吸虫样本的四个生物复制品（列）中差异表达基因（系）的层次聚类，无论是对照还是治疗寄生虫，如热图顶部所示。寄生虫暴露48小时在体外至车辆（控制）或至20μM GSK343。基因表达水平通过RNA-seq测量，并以Z分数表示，Z分数是低于（蓝色，下调）或高于（红色，上调）每个基因治疗和对照样品平均表达值的标准偏差数；表达水平的Z分数是按照底部刻度所示的颜色编码的。
图10
图10。RNA-seq检测成人下调基因的基因本体术语富集分析S公司.曼索尼GSK343处理的雌雄蠕虫。
女性差异表达下调基因的前20个富集GO术语（A）男性（B）成虫。三个主要GO术语类别，即生物过程、细胞成分和分子功能，分别在每个面板中表示。圆圈的大小与每个显著富集类别中的基因数量成正比，如下部刻度所示；颜色显示了富集的统计意义，如底部彩色编码标尺中出现的-log10 FDR值所示。使用FDR≤0.05的GO富集显著性截止值。
图11
图11。RNA-seq检测成人上调基因的基因本体术语富集分析S公司.曼索尼GSK343处理的雄性蠕虫。
雄性成虫差异表达上调基因的前20个丰富GO术语。三个主要GO术语类别，即生物过程、细胞成分和分子功能，分别在每个面板中表示。圆圈的大小与每个显著富集类别中的基因数量成正比，如下部刻度所示；颜色显示了富集的统计意义，如底部彩色编码标尺中出现的-log10 FDR值所示。采用FDR≤0.05的GO富集显著性临界值；在上调的雌性基因中没有发现显著富集的GO术语。
图12
图12。与GSK343处理的雌性成虫中下调的DNA复制相关的基因。
（A）32个与DNA复制相关的基因的热图，这些基因在接受治疗的雌性中被下调。基因显示在线条上，三个生物复制品显示在柱中，用于对照（柱顶部的绿松石条）或GSK343处理的雌性样品（柱顶部为黄色条）。寄生虫暴露48小时在体外至车辆（控制）或至20μM GSK343。基因表达水平通过RNA-seq测量，并以Z分数表示，Z分数是低于（蓝色，下调）或高于（红色，上调）每个基因治疗和对照样品平均表达值的标准偏差数；表达水平Z分数被颜色编码，如在底部的刻度上所指示的。热图是通过对样本和基因进行无监督聚类得到的。（B）如底部图例所示，通过RNA-seq对来自（A）的32个基因的表达进行主成分分析（PCA），这些基因在对照组和治疗组的雌性、雄性和血吸虫中进行了测量。
图13
图13。GSK343处理的雌性成虫中下调的与ncRNA代谢、卵子生物合成和细胞分化相关的基因。
（A）51个与ncRNA代谢相关的基因的热图，这些基因在接受治疗的雌性中被下调。热图是通过对样本和基因进行无监督聚类得到的。（B）如底部图例所示，通过RNA-seq对来自（A）的51个基因的表达进行主成分分析（PCA），这些基因在对照组和治疗组的雌性、雄性和血吸虫中进行了测量。（C）与卵子生物合成和细胞分化相关的9个选定基因的热图，其在GSK343处理的雌性中的表达受到显著影响。通过无监督的基因聚类获得的热图。在（A）和（C）的热图中，基因显示在线条上，三个生物复制品显示在柱中，用于对照（柱顶部的绿松石条）或GSK343处理的雌性样品（柱顶部为黄色条）。寄生虫暴露48小时在体外至车辆（控制）或至20μM GSK343。基因表达水平通过RNA-seq测量，并以Z分数表示，Z分数是低于（蓝色，下调）或高于（红色，上调）每个基因治疗和对照样品平均表达值的标准偏差数；表达水平的Z分数是按照底部刻度所示的颜色编码的。
图14
图14。GSK343处理的血吸虫中RNA-seq检测到的差异表达基因的基因本体术语富集分析。
血吸虫差异表达基因的丰富GO术语，由下调基因分离（A）和上调的基因（B）。三个主要GO术语类别，即生物过程、细胞成分和分子功能分别在每个面板中表示。圆圈的大小与每个显著富集类别中的基因数量成正比，如下部刻度所示；颜色显示了富集的统计意义，如底部彩色编码标尺中出现的-log10 FDR值所示。使用FDR≤0.05的GO富集显著性截止值。
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