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.2018年10月24日；9(1):4429.
doi:10.1038/s41467-018-06841-7。

核乳酸脱氢酶A感应活性氧产生α-羟丁酸促进HPV诱导的宫颈肿瘤生长

袁刘（音） 1, 郭继正 2 三, 刘莹（音） 4, Kui Wang（奎王） 1, 丁文成 5, Hui Wang（王慧） 5, 刘翔（音） 6, 周圣涛 7, 陆晓晨 2, 杨洪斌 2, 徐晨岳 4, 魏高 1, 李周 1, 王一平 2, 胡卫国 8, 玉泉卫 9, 黄灿华 10, 群英雷 11 12
附属公司

核乳酸脱氢酶A感应活性氧产生α-羟丁酸促进HPV诱导的宫颈肿瘤生长

袁刘（音）等。 国家公社. .

摘要

众所周知，高危人类乳头状瘤病毒（HR-HPV）感染与宫颈癌密切相关，E7被确定为HPV介导致癌的关键启动子之一。在这里，我们表明，由于E7诱导的细胞内活性氧（ROS）积累，乳酸脱氢酶A（LDHA）最好位于HPV16阳性宫颈肿瘤的细胞核中。令人惊讶的是，核LDHA获得了一种非标准酶活性来产生α-羟基丁酸，并触发DOT1L（端粒沉默类似物的破坏者）介导的组蛋白H3K79超甲基化，从而激活抗氧化反应和Wnt信号通路。此外，HPV16 E7基因敲除可降低K14-HPV16转基因小鼠模型中LDHA核转位和H3K79三甲基化。HPV16 E7水平与宫颈癌细胞核LDHA和H3K79三甲基化显著正相关。总之，我们的发现揭示了核LDHA的一种非标准酶活性，其表观遗传学控制细胞氧化还原平衡和细胞增殖，促进HPV诱导的宫颈癌的发展。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
HPV16/18 E7通过ROS积累诱导LDHA核转位。一在HPV16阳性的宫颈癌组织中，LDHA明显移位到细胞核。HPV16阴性和阳性宫颈肿瘤标本中LDHA定位的代表性IHC图像。比例尺，100 μm。b条核LDHA在HPV16阳性的宫颈癌组织中显著增加。对HPV16阴性患者进行半定量细胞质LDHA和细胞核LDHA评分(n个 = 27）和积极(n个 = 39）宫颈肿瘤标本。c（c）,d日HPV16/18 E7以ROS依赖的方式促进LDHA核易位。稳定表达载体或标记的HPV16/18 E7的原代人宫颈角质形成细胞（PHKs）经1 mM NAC用于6 h、 然后用抗LDHA（绿色）、抗Flag（红色）抗体和DAPI（蓝色）染色。比例尺，10 微米(c（c）). 定量分析LDHA核型变小的细胞占总细胞数的百分比(d日).e（电子）HPV16/18 E7提高ROS产量。在稳定表达载体或HPV16/18 E7偶联或不偶联1 mM NAC治疗6 h、 然后使用ROS敏感荧光染料（CM-h2DCFDA），根据制造商的协议使用流式细胞仪。（f）,克LDHA核转位在H2O（运行）2-剂量依赖性方式。不同剂量H对HaCaT细胞LDHA（绿色）的免疫荧光图像2O（运行）2按照指示进行处理。DAPI，蓝色。比例尺，10 微米(（f）). 定量分析LDHA核型变小的细胞占总细胞数的百分比(克).小时活性氧促进LDHA核移位。HT-3细胞接受或不接受10 微米高2O（运行）2用于6 h、 并添加或不添加1 mM NAC用于扩展6 h用于核分离，然后用LDHA、Tubulin和Lamin B1进行印迹。结果代表了三个独立的实验。所有数据均显示为平均值 ± 扫描电镜第页值由双尾确定t吨-测试。的值第页<0.05被认为具有统计学意义，和***表示第页<0.05,第页<0.01，以及第页<分别为0.001。NS表示不重要
图2
图2
核LDHA获得一种产生α-HB的非经典酶活性。一典型和非典型LDHA酶活性示意图。b条HPV16 E7增强LDHA的非经典酶活性。在稳定表达载体HPV16 E7的HaCaT和HT-3细胞中，测定了典型和非典型LDHA酶活性 mM NAC治疗6 小时。c（c）ROS提高LDHA的非经典酶活性。用或不用10 微米高2O（运行）2用于6 h、 并添加或不添加1 mM NAC用于扩展6 h用于测量标准和非标准LDHA酶活性。d日HPV16 E7表达积累细胞α-HB。从稳定表达载体或HPV16 E7的HT-3细胞中提取的代谢物样品 mM NAC治疗6 通过LC-MS/MS分析所示h，显示相对丰度（通过代谢物峰面积）。e（电子）ROS积累细胞α-HB。经或不经10 微米高2O（运行）2用于6 h、 并添加或不添加1 mM NAC用于扩展6 通过液相色谱-三重四极杆串联质谱（LC-MS/MS）分析指示的h，显示相对丰度（通过代谢物峰面积）。（f）核LDHA具有较高的非经典酶活性。在HeLa稳定细胞中测定典型和非典型酶活性LDHA公司击倒和Vec/WT/NLS/NES救援。Vec，矢量；WT，野生型；NLS，核定位信号；NES，核出口信号。克LDHA核转位积累细胞α-HB。从HeLa稳定细胞中提取的代谢物样品LDHA公司通过LC-MS/MS分析敲除和Vec/WT/NLS/NES救援，显示了相对丰度（通过代谢物峰面积）。LDHA酶活性归一化为LDHA蛋白水平。相对代谢物丰度根据细胞数进行标准化。结果代表了三个独立的实验。所有数据均显示为平均值 ± 扫描电镜第页值由双尾确定t吨-测试。的值第页<0.05被认为具有统计学意义，和***表示第页<0.05,第页<0.01，以及第页<分别为0.001。NS表示不重要
图3
图3
ROS破坏LDHA四聚体的形成并促进非经典酶的活性。一,b条ROS干扰LDHA四聚体的形成。含或不含10的HaCaT和HT-3细胞提取物 微米高2O（运行）2用0.025%戊二醛交联处理，并用LDHA抗体进行蛋白质印迹分析。显示了四聚体、二聚体和单体LDHA(一). HT-3细胞提取物由1 × 107有或没有10个单元格 微米高2O（运行）2处理并通过凝胶过滤柱。每0.25次收集一次分数 ml/管，并通过western blot分析LDHA蛋白。分子质量，158和43 用凝胶过滤校准试剂盒HMW（GE Healthcare）测定印迹下方标记的kDa。凝胶过滤的加载输入如下所示(b条).c（c）二聚体LDHA具有非标准酶活性。对凝胶过滤分离出的四聚体组分（分数#56，#57）和二聚体组份（分数#60，#61）进行标准和非标准LDHA酶活性测定。d日,e（电子）LDHA中形成更多二聚体荷兰统计局组与LDHA组比较NES公司组。HEK293T细胞提取物LDHA公司用0.025%戊二醛交联表达Flag-tagged WT、NLS和NES LDHA的KO细胞，并用LDHA抗体进行western印迹分析。显示了四聚体、二聚体和单体LDHA(d日). HEK293T细胞提取物LDHA公司表达Flag-tagged WT、NLS和NES LDHA的KO细胞通过凝胶过滤柱。每0.25次收集一次分数 ml/管，并通过western blot分析LDHA蛋白。分子量由凝胶过滤校准试剂盒HMW（GE Healthcare）测定。结果代表了三个独立的实验。所有数据均显示为平均值 ± 扫描电镜第页值由双尾确定t吨-测试。的值第页<0.05被认为具有统计学意义，和***表示第页<0.05,第页<0.01，以及第页<分别为0.001。NS表示不重要
图4
图4
DOT1L介导α-HB诱导的H3K79超甲基化。一α-HB上调H3K79三甲基化。在1 mM四种LDHA相关代谢物治疗24例 h.控制；α-HB，α-羟基丁酸钠；α-KB，α-酮丁酸钠；乳酸钠；丙酮酸钠。量化H3K79甲基化/H3比率。b条ROS增加H3K79三甲基化。10天后分析HaCaT和HT-3细胞中H3K79甲基化水平 微米高2O（运行）2用于6 h带或不带1 mM NAC预处理1 h，如图所示。量化H3K79甲基化/H3比率。c（c）E7表达增强H3K79三甲基化。在稳定表达载体或标记HPV16/18 E7的PHKs和HaCaT细胞中分析H3K79甲基化水平 mM NAC治疗6 h.H3K79甲基化/H3比率被量化。d日DOT1L介导核LDHA诱导的H3K79超甲基化。HeLa稳定细胞LDHA公司击倒和标记Vec/WT/NLS/NES救援分别接受或不接受3次 μM EPZ004777用于48 h、 结合或不结合1 mM钠α-HB用于48 h，如图所示。β-肌动蛋白和组蛋白H3用作所有免疫印迹的负荷控制。e（电子）E7触发DOT1L与LDHA的绑定。DOT1L在稳定表达载体或HPV16 E7的HT-3细胞中的内源性共免疫沉淀 mM NAC治疗6 h、 LDHA和DOT1L的印迹。（f）ROS触发DOT1L与LDHA的结合。DOT1L在含有或不含有10的HT-3细胞中的内源性共免疫沉淀 微米高2O（运行）2用于6 h或1 mM NAC用于6 h，然后用LDHA和DOT1L进行吸干。克α-HB诱导DOT1L与LDHA结合。HaCaT和HT-3细胞内DOT1L和LDHA的可逆内源性共免疫沉淀 mMα-HB用于24 h、 然后用LDHA和DOT1L进行印迹。结果代表了三个独立的实验。所有数据均显示为平均值 ± 扫描电镜第页值由双尾确定t吨-测试。的值第页<0.05被认为具有统计学意义，和***表示第页<0.05,第页<0.01，以及第页<分别为0.001。NS表示不重要
图5
图5
核LDHA诱导的抗氧化反应需要NRF2。一E7诱导抗氧化和Wnt靶基因的表达。qPCR检测载体中的抗氧化剂和Wnt靶基因（经或不经H处理）2O（运行）2)或HPV16 E7-表达的HT-3细胞，用或不用NAC处理，如图所示。b条E7提高了基因体上的H3K79二甲基化水平。ChIP-qPCR显示H3K79me2在SOD1标准,猫,CTNNB1公司、和MYC公司与载体或HPV16 E7表达的HaCaT细胞中输入基因组DNA相关的基因体，经NAC或不经NAC处理。c（c）EPZ004777块增加NQO1号机组和GCLC公司E7和H诱导的基因表达2O（运行）2.qPCR检测NQO1号机组和GCLC公司载体中的基因（用或不用H处理2O（运行）2)或用NAC或不用NAC处理的HPV16 E7表达的HaCaT细胞和3 μM EPZ004777用于24 h，如图所示。d日,e（电子） NRF2级KO或NRF2抑制阻断增加nq1型和GCLC公司E7和H诱导的基因表达2O（运行）2.qPCR检测NQO1号机组和GCLC公司HeLa中的基因NRF2级经或不经H处理的KO细胞2O（运行）2(e（电子）)，以及经或不经10 24μM ML385 小时(（f）)如图所示。（f） LDHA公司KO减少NQO1号机组和GCLC公司H激活的基因表达2O（运行）2.qPCR检测NQO1号机组和GCLC公司HeLa中的基因LDHA公司H上的KO电池2O（运行）2结合或不结合所示的延长NAC治疗。克 LDHA公司KO减弱基因体上的H3K79二甲基化水平。ChIP-qPCR显示H3K79me2在SOD1标准,猫,CTNNB1公司、和MYC公司HeLa中相对于输入基因组DNA的基因体LDHA公司KO和NRF2级经或不经H处理的KO细胞2O（运行）2在ChIP-qPCR检测中，将兔IgG作为阴性对照。H（H）2O（运行）2用作10 6μM h、 NAC被用作1 6 mM h.结果代表三个独立实验。所有数据均显示为平均值 ± 扫描电镜第页值由双尾确定t吨-测试。的值第页<0.05被认为具有统计学意义，和***表示第页<0.05,第页<0.01，以及第页<分别为0.001。NS表示不重要
图6
图6
核LDHA产生的α-HB保护宫颈癌细胞免受氧化应激。一,b条核LDHA在氧化应激下促进细胞生长。HeLa稳定细胞的生长曲线LDHA公司击倒和Vec/WT/NLS/NES救援分别在有或无10 微米高2O（运行）2治疗。c（c）核LDHA增加氧化应激下的菌落形成。用或不用10处理HeLa稳定细胞的集落形成分析 微米高2O（运行）2.d日活性氧增强LDHA靶基因表达重量和LDHA荷兰统计局但不是LDHANES公司稳定细胞。含或不含10的HeLa稳定细胞中抗氧化和Wnt靶基因的qPCR 微米高2O（运行）2治疗6次 小时。e（电子）核LDHA下调细胞ROS水平。使用ROS敏感荧光染料CM-H在HeLa或HeLa稳定细胞中测量细胞ROS2流式细胞术检测DCFDA。（f）α-HB平衡LDHA中细胞ROS水平NES公司氧化应激下的稳定细胞。在HeLa LDHA中测量细胞活性氧NES公司用1处理的稳定细胞 mMα-HB钠补充48 h耦合或不耦合50 微米高2O（运行）2治疗30次 min，使用ROS敏感荧光染料CM-H2流式细胞术检测DCFDA。克α-HB恢复LDHA中的基因表达NES公司氧化应激下的稳定细胞。HeLa LDHA中抗氧化和Wnt靶基因的qPCRNES公司用10处理的稳定细胞 微米高2O（运行）2用于6 h、 有或没有1 24小时mMα-HB钠补充剂 小时。小时α-HB拯救LDHANES公司氧化应激下的细胞生长。HeLa LDHA生长曲线NES公司用10处理的稳定细胞 微米高2O（运行）2添加或不添加不同剂量的α-羟基丁酸钠。我α-HB恢复LDHANES公司氧化应激下的菌落形成。HeLa LDHA的集落形成测定NES公司用10处理的稳定细胞 微米高2O（运行）2添加或不添加不同剂量的α-羟基丁酸钠。对于细胞增殖和克隆形成分析，每24天更换一次培养基 h代表h2O（运行）2分解。结果代表了三个独立的实验。所有数据均显示为平均值 ± 扫描电镜第页值由双尾确定t吨-测试。的值第页<0.05被认为具有统计学意义，和***表示第页<0.05,第页<0.01，以及第页<分别为0.001。NS表示不重要
图7
图7
HPV16 E7诱导的LDHA核移位与宫颈癌的发生有关。一,b条,c（c）LDHA公司荷兰统计局增加异种裸鼠模型的肿瘤生长。HeLa的代表性图像（左侧为Vec，右侧为WT的1号小鼠，左侧为NLS，右侧为NES的1号鼠）LDHA公司用Vec/WT/NLS/NES击退异种移植物小鼠(一). HeLa移植异种小鼠的切除肿瘤LDHA公司带有Vec/WT/NLS/NES推回单元的KO(b条)并表示第30天的肿瘤体积(c（c）).d日LDHA公司荷兰统计局肿瘤显示H3K79me2、NRF2、SOD1和MYC水平升高。采用western blotting分析两对代表性肿瘤中H3K79me2水平和NRF2、SOD1和MYC的表达。β-肌动蛋白和组蛋白H3作为负荷对照。e（电子）在K14-HPV16转基因小鼠中，LDHA核转位与H3K79三甲基化呈正相关。在TALEN介导的K14-HPV16转基因小鼠靶向E7的指定时间点，HPV16 E7表达、LDHA定位和H3K79me3水平的代表性IHC图像。n个 = 每组3个。比例尺，50 微米。（f）人宫颈癌组织中HPV16 E7水平、LDHA核转位和H3K79三甲基化水平呈正相关。根据肿瘤HPV16 E7表达评分将52例患者分为四组。水平线表示中间带。数据显示为平均值 ± 扫描电镜第页值由双尾确定t吨-测试。的值第页<0.05被认为具有统计学意义，和***表示第页<0.05,第页<0.01，以及第页<分别为0.001。NS表示不显著。克提出了LDHA在应对HR-HPV感染中的非经典作用的分子机制模型。PYR、丙酮酸盐、LAC、乳酸盐、α-KB、α-酮丁酸盐和α-HB、α-羟基丁酸盐
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