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.2018年11月;38(11):2691-2705.
doi:10.1161/ATVBAHA.118.311689。

TSPAN12(Tetraspanin 12)的内皮细胞特异性失活揭示了其他完整血管屏障缺陷的病理后果

附属公司

TSPAN12(Tetraspanin 12)的内皮细胞特异性失活揭示了其他完整血管屏障缺陷的病理后果

张驰(Chi Zhang)等。 动脉硬化血栓血管生物. 2018年11月.

摘要

目的-血-中枢神经系统屏障缺陷与视网膜病变、神经退行性疾病、中风和癫痫有关,但屏障缺陷下游的病理机制尚不完全清楚。血视网膜屏障(BRB)的形成和视网膜血管生成需要由配体norrin(NDP[Norrie disease protein])、受体FZD4(frizzled 4)、共受体LRP5(低密度脂蛋白受体样蛋白5)和四spanin TSPAN12(tetraspanin 12)诱导的β-catenin信号。NDP/FZD4信号受损会导致家族性渗出性玻璃体视网膜病变,可能导致失明。本研究旨在确定TSPAN12在视网膜中的细胞类型特异性功能。方法和结果-使用三苯氧胺诱导的Cdh5-CreERT2驱动因子,在内皮细胞中生成并重组了loxP-侧翼的Tspan12等位基因。使用共焦显微镜记录结果表型。对老龄小鼠的视网膜进行RNA-Seq、组织病理学分析和视网膜电图。我们表明,TSPAN12在内皮细胞中发挥作用,促进发育中小鼠的血管形态发生和BRB形成,并在成年小鼠中维持BRB。内皮细胞中TSPAN12的早期丢失导致视网膜内毛细血管的缺乏和VE粘附素(CDH5[cadherin5 aka VE-cadherin])的表达增加,这与血管过早静止一致。晚期TSPAN12的丢失严重损害了BRB的维持,而不影响血管形态发生、周细胞覆盖或灌注。长期BRB缺陷与免疫球蛋白外渗、补体沉积、囊样水肿和视网膜电图b波受损有关。RNA测序揭示了对BRB扰动的转录反应,包括与糖尿病视网膜病变血管基底膜改变有关的基因。结论:本研究建立了具有晚期内皮细胞特异性Tspan12缺失的小鼠模型,以研究其他完整血管中BRB损伤的病理后果。

关键词:血脑屏障;糖尿病性视网膜病变;水肿;内皮细胞;炎症。

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数字

图1。
图1。
血管形态发生和血-视网膜屏障缺陷茨潘12−/−老鼠。A类,用mTSPAN12(m-tetraspanin 12)探针组进行分支DNA原位杂交和扩增,用IsoectinB4复染以标记血管内皮细胞(EC)。插图突出显示了穿过内网状层的毛细血管;m茨潘12探针与该结构杂交。B类,控制部分处理用于信号放大和检测。C类,TSPAN12蛋白质拓扑的示意图。起始ATG和第一跨膜片段的主要部分由外显子3编码。D类,生成m的目标策略示意图茨潘12LoxP侧翼等位基因。E类,长程聚合酶链反应(PCR)在用于胚泡注射的ES细胞克隆的基因组DNA上产生预期的杂合模式。F类,IgG局限于血管腔内,P16的三层血管系统发育正常茨潘12+/−老鼠。这个左边显示了代表所有3个毛细管层的光学截面产生的最大强度投影(MIP)。图中显示了视网膜整块支架的一片花瓣。显示装箱区表面血管的光学切片在中间的. The正确的显示了装箱区域中所有光学部分的颜色深度投影。G公司,观察到大量IgG泄漏和视网膜内毛细血管缺乏茨潘12−/−老鼠。H(H)未能抑制突变小鼠EC中的开窗成分PLVAP(质膜囊泡相关蛋白)。比例尺A类B类,20µm和F类通过200微米。GCL表示神经节细胞层;INL,内核层;IPL,内丛状层;ONL,外核层;OPL,外丛状层。
图2。
图2。
VE-cadherin表达增加茨潘12−/−视网膜。A类B类,P6视网膜整体支架的免疫染色显示VE-cadherin表达增加坦桑尼亚12/−视网膜内皮细胞(EC)。中部正确的将方框区域放大显示。C类,量化VE-cadherin染色强度,n=8个视野,每个基因型2个视网膜。数据标准化为野生型(WT)强度,显示平均值+标准偏差。D类,所示基因型的视网膜裂解物的免疫印迹显示VE钙粘蛋白表达增加。E类,量化每个基因型n=3 P8-10视网膜裂解物的免疫印迹带强度。每个裂解液汇集1只动物的两个视网膜。数据标准化为野生型强度,显示平均值+标准偏差。比例尺:200µm。KO表示击倒;血小板内皮细胞粘附分子PECAM。
图3。
图3。
TSPAN12(tetraspanin 12)在视网膜血管内皮细胞(EC)中的功能。A类,无BRB(血-视网膜屏障)和血管形态发生缺陷茨潘12弗洛克斯/−控制。B类茨潘12弗洛克斯/+; Cdh5-CreERT2公司+控制。C类、IgG和IB4染色显示BRB缺陷和视网膜内毛细血管缺失茨潘12在EC中。D类E类,未能抑制ECs中的PLVAP(质膜囊泡相关蛋白)茨潘12弗洛克斯/−; Cdh5-CreERT2公司+老鼠。F类G公司、正常BRB和失活后的血管形态发生茨潘12在视网膜前体细胞和(H(H))壁画细胞。比例尺200µm。IPL表示内网状层;MIP,最大强度投影;OPL,外丛状层。
图4。
图4。
TSPAN12(tetraspanin 12)是在其他完整的血管系统中维持BRB(血-视网膜屏障)所必需的。A类,IgG局限于对照小鼠的血管腔内。B类,P28处内皮细胞(EC)特异性重组后1个月IgG泄漏。C类D类在P28处EC特异性重组6个月后,在没有血管形态发生缺陷的情况下出现BRB缺陷。E类F类,结蛋白阳性壁细胞覆盖成人是正常的坦桑尼亚12ECKO视网膜在青少年时期重组。G公司量化壁画细胞覆盖率。量化每个基因型4个视网膜的16个视野,显示平均+标准差。H(H)PECAM(血小板内皮细胞粘附分子)和IgG的经心荧光素异硫氰酸盐(FITC)-右旋糖酐500kDa灌注和免疫染色。茨潘12ECKO视网膜在完全灌注的其他完整的血管系统中显示出强烈的IgG外渗。在单独的面板中放大显示的方框区域。FITC-右旋糖酐信号和PECAM信号生成的深度投影的比较表明,视网膜内毛细血管也完全灌注。比例尺:200µm。IPL表示内网状层;MIP,最大强度投影;OPL,外丛状层。
图5。
图5。
老年人视网膜补体沉积与组织病理学变化茨潘12ECKO小鼠。A类补体因子C4在视网膜血管、内核层(INL)和外丛状层(OPL)周围沉积。白色箭头指向一些用补体装饰的小囊状病变。B类对照视网膜的H&E染色和变异视网膜相对强烈的受影响区域显示出与水肿一致的囊样病变。C类,突变视网膜小胶质细胞F4/80染色增强。D类通过F类、IgG、转铁蛋白和白蛋白的外渗茨潘12ECKO视网膜。G公司12月龄ECKO小鼠视网膜血管COL4(collagen IV)染色增强,内界膜(白色箭头)染色作为内部染色控制。
图6。
图6。
补体因子C4与几种视网膜细胞类型的配色。A类,十二个月大茨潘12ECKO视网膜横截面用抗C4和IB4染色。将显示拆分和合并的通道。箭头表示用C4装饰的血管。B类,在视网膜细胞亚群和突变组织中囊样病变边缘上渗出的IgG和C4的结肠化。C类,杆状双极细胞间距在突变组织中似乎增加了。该切片还显示了1或2个C4去核的Müller胶质细胞,这些细胞通过向外界膜延伸而被识别(箭头所示)。D类,突变组织中的Müller细胞紊乱。Sox9标记Müller胶质细胞核。箭头突出显示了一个C4脱细胞,根据细胞体位置和细胞形状,该细胞被识别为无长突细胞。E类,C4与小胶质细胞标记物IBA-1的部分共定位。PKC表示蛋白激酶C;和Sox9,SRY-box 9。
图7。
图7。
老年人视网膜电图中受损的b波茨潘12ECKO小鼠。A类,在暗适应和光适应条件下记录的视网膜电图示例。B类,B波振幅在茨潘12ECKO小鼠。N=12(对照组)或N=6(ECKO)视网膜,显示平均振幅+扫描电镜。使用非参数Mann-Whitney U测试光适应b波数据的显著性测试.

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