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.2018年11月；16(5):4010-4018.
doi:10.3892/etm.2018.6679。 Epub 2018年9月3日。

miR-186通过抑制凋亡蛋白酶激活因子-1促进皮肤鳞癌的肿瘤生长

景天 1, 芮申 2, 于章燕 3, 列华登 1
附属公司

miR-186通过抑制凋亡蛋白酶激活因子-1促进皮肤鳞癌的肿瘤生长

景天等。 实验治疗学. 2018年11月.

摘要

皮肤鳞状细胞癌（cSCC）占全球非黑色素瘤皮肤癌的20%。微小RNA（miRNA或miRs）是一种与各种类型的人类癌症进展相关的非编码RNA亚型。MiR-186已被证明在人类肿瘤中作为癌基因发挥作用。然而，miR-186在cSCC中的作用尚不清楚。采用逆转录定量聚合酶链反应、western blotting和免疫荧光检测miR-186和凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）的表达。miR-186和APAF1之间的相关性通过双核糖核酸酶分析测定。将miR-186的模拟物或抑制剂转染到A-431细胞中，分别建立miR-86过表达或敲低的细胞系。EdU染色和集落形成试验检测细胞增殖。采用Transwell和创伤愈合试验分别分析细胞侵袭和迁移。采用Hoechst染色和流式细胞术评估细胞凋亡和细胞周期分布。与对照组相比，cSCC组织中MiR-186的表达显著增加，而APAF1的表达显著降低。预测APAF1中存在miR-186结合位点，且其在cSCC组织中的表达呈负相关。与对照组相比，miR-186过表达的A-431细胞的细胞增殖、侵袭和迁移显著增强，而miR-186-敲除细胞的细胞则减弱。miR-186调节APAF1的表达，而APAF1敲除显著促进细胞侵袭并抑制细胞凋亡。总之，本研究结果表明，miR-186通过抑制APAF1而成为cSCC的癌基因。

关键词：细胞凋亡；凋亡蛋白酶激活因子1；皮肤鳞状细胞癌；入侵；微小RNA-186；迁移；增殖。

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数字

图1。
图1。
cSCC组织中miR-186和APAF1的表达及其相关性。采用逆转录定量聚合酶链反应检测（A）miR-186和（B）APAF1在cSCC组织及其相应对照中的表达。（C） miR-186表达与APAF1表达的相关性。（D） Western blotting检测APAF1在cSCC组织和相应对照中的蛋白表达***P<0.001。miR，microRNA；皮肤鳞状细胞癌；APAF1，凋亡蛋白酶激活因子1。
图2。
图2。
miR-186和APAF1之间的相互作用。（A） TargetScan用于揭示miR-186和APAF1 mRNA的序列比对***与NC组相比，P<0.001。NC，阴性对照；miR，microRNA；凋亡蛋白酶激活因子1；WT，野生型；MUT，突变体；UTR，未翻译区域。
图3。
图3。
miR-186过表达或敲低对A-431细胞中APAF1表达的影响。在转染miR-186模拟物或抑制剂的A-431细胞中，采用逆转录定量聚合酶链反应检测（A）miR-86和（B）APAF1的表达*与NC组相比，P<0.05、**P<0.01和***P<0.001；##与模拟组相比，P<0.01。（C） 采用免疫荧光分析研究转染miR-186模拟物或抑制剂的A-431细胞中APAF1的表达。放大倍数，×200。（D） Western blotting检测miR-186过表达或敲低A-431细胞中APAF1、LC3-B和Beclin1蛋白的表达。内部控制采用GAPDH。NC，阴性对照；miR，microRNA；凋亡蛋白酶激活因子1；LC3-B，轻链3B。
图4。
图4。
miR-186过度表达或敲除对A-431细胞的细胞增殖、凋亡、侵袭和细胞周期进展的影响。（A） 在NC、miR-186模拟物和miR-186抑制剂组中进行EdU染色。红色表示EdU染色，蓝色表示DAPI。放大倍数，×100。（B） 进行集落形成试验以评估miR-186对NC、模拟物和抑制剂组细胞增殖的影响。放大倍数，×100。（C） 采用Transwell法检测转染NC、模拟物或抑制剂的A-431细胞的侵袭能力。放大倍数，×200。（D） 采用创伤愈合试验评估经NC、模拟物或抑制剂处理的A-431细胞的迁移能力。放大倍数，×100。通过（E和F）Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术分析，分别评估miR-186对miR-186-过表达或抑制的A-431细胞中（E）细胞凋亡和（F）细胞周期分布的影响*与NC组相比，P<0.05，**P<0.01。##与模拟组相比P<0.01。NC，阴性对照；miR，microRNA；凋亡蛋白酶激活因子1；异硫氰酸荧光素；PI，碘化丙啶。
图5。
图5。
APAF1敲除对A-431细胞增殖和凋亡的影响。（A） 通过逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction）检测miR-186在含有或不含si-APAF1的A-431细胞中的表达。（B） 采用Western blotting检测在有或无si-APAF1的情况下，经miR-186抑制剂处理的A-431细胞中APAF1、LC3B和Beclin1蛋白的表达。（C） 使用Matrigel分析测定了单独或与si-APAF1联合使用miR-186抑制剂处理的A-431细胞的侵袭能力。放大倍数，×200。（D） 采用Hoechst 33258染色法评估转染miR-186抑制剂的A-431细胞的凋亡情况。放大倍数，×400**与抑制剂+NC.APAF1、凋亡蛋白酶激活因子1相比，P<0.01；LC3-B，轻链3B；miR，microRNA；si，短干扰；NC，阴性对照。
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