Platelets isolated from an Alzheimer mouse damage healthy cortical vessels and cause inflammation in an organotypic ex vivo brain slice model

doi:10.1038/s41598-018-33768-2

.2018年10月19日；8(1):15483.

doi:10.1038/s41598-018-33768-2。

阿尔茨海默病小鼠分离的血小板在器官型离体脑切片模型中损伤健康的皮层血管并引起炎症

凯瑟琳·尼克瓦勒¹, Bettina M Foidl公司¹, 克里斯蒂安·汉佩尔²

附属公司

¹奥地利因斯布鲁克医科大学精神病I系精神病学与实验性阿尔茨海默病研究实验室。
²奥地利因斯布鲁克医科大学精神病I系精神病学与实验性阿尔茨海默病研究实验室。christian.humpel@i-med.ac.at。

PMID： 30341392
预防性维修识别码：项目经理6195547
内政部： 10.1038/s41598-018-33768-2

阿尔茨海默病小鼠分离的血小板在器官型离体脑切片模型中损伤健康的皮层血管并引起炎症

凯瑟琳·尼克瓦勒等。科学代表. 2018.

.2018年10月19日；8(1):15483.

doi:10.1038/s41598-018-33768-2。

作者

凯瑟琳·尼克瓦勒¹, 贝蒂娜·福伊德¹, 克里斯蒂安·汉佩尔²

附属公司

¹奥地利因斯布鲁克医科大学精神病I系精神病学与实验性阿尔茨海默病研究实验室。
²奥地利因斯布鲁克医科大学精神病I系精神病学与实验性阿尔茨海默病研究实验室。christian.humpel@i-med.ac.at。

PMID： 30341392
预防性维修识别码：项目经理6195547
内政部： 10.1038/s41598-018-33768-2

摘要

血小板是无核血细胞，在止血和血栓形成中起主要作用。血小板表达淀粉样前体蛋白（APP），释放β-淀粉样蛋白（Aβ），并在阿尔茨海默病（AD）中受到刺激（预激活）。我们假设这些受刺激的血小板会严重损伤脑血管，继而导致AD的脑血管损伤。为了研究这个问题，我们从AD小鼠中分离血小板（表达带有Swedish-Dutch-Iowa突变的APP），用红色荧光染料PKH26标记这些血小板，然后将这些新分离的血小板经心注入麻醉的健康C57BL6野生型小鼠的大脑。立即取脑，制备110µm厚的器官型脑片并培养1或14天。我们观察到红色PKH26⁺荧光血小板定位于IV型胶原和凝集素649复染的皮层脑血管中，来自AD小鼠的血小板严重损伤野生型小鼠的皮层脑动脉并进入脑实质。共焦显微镜显示这些血小板周围的基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）和β-淀粉样蛋白呈免疫反应性。MMP抑制剂可完全抑制这种作用。此外，分离的AD血小板引起炎症，并激活血小板损伤大脑皮层血管的部位周围的小胶质细胞。我们的结论是，AD衍生血小板会更积极地损害健康血管，从而可能在AD脑淀粉样血管病的进展中发挥作用。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
工作流显示了实验设计和执行实验的时间（平均值 ± SEM分钟）。WT，野生型；TG，转基因阿尔茨海默病小鼠。

图2
分离血小板的FACS分析。FACS分析显示正向与侧向散点图中的单个细胞群(一)以及在计数与FSC印迹中(b条). 作为对照，始终使用相应的IgG对照，显示背景染色(**c（c）**). 分离血小板的FACS分析显示GPIIbIIIa（CD41/CD61）阳性染色(d日)，GPIX（CD42a）(克)和GPIbα（CD42b）(小时). 未经处理的血小板中未观察到活化的GPIIbIIIa染色(电子)然而，凝血酶激活后这一作用增强(**（f）**). 图(我)再次显示IgG对照物与GPIbα。定量分析如图所示(j个)，野生型或转基因小鼠之间没有变化。然而，凝血酶激活诱导野生型和转基因血小板中的GPIIbIIIa。但转基因小鼠的血小板对凝血酶激活不太敏感(k个). 数值为平均值 ± 扫描电镜（n = 6–7）；统计分析由学生进行T检验（***p < 0.001).

图3
注射野生型小鼠分离的PKH26标记血小板(一——**（f）**)或转基因阿尔茨海默病小鼠(克,小时)变成健康的C57BL6野生型小鼠。将新分离的PKH26标记的血小板缓慢经心注入野生型小鼠，取脑，用振动切片器切片至110 µm厚的器官型脑片，培养2周，并用IV型胶原进行复染。绿色通道（EX 480/40）中可见IV型胶原Alexa-488 纳米，EM 527/30 nm）和红色通道中的红色PKH26血小板（EX 535/50，EM 610/75）(一,**c（c）**——电子). 用氩激光线对IV型胶原Alexa-488进行共聚焦成像⁺容器和用于PKH26的DPSS561nm激光器⁺血小板(b条,**（f）**——小时). 从野生型小鼠分离的PKH26（红色）标记血小板存在于IV型胶原（绿色）血管中(一,**c（c）**——电子)，但它们不会损坏和穿透健康的血管(b条,**（f）**). 然而，从转基因阿尔茨海默病小鼠中分离并注入野生型小鼠体内的血小板会损伤并穿透健康血管(克,小时，箭头）。比例尺输入一 = 115 微米(一)，第5页微米(b条,**（f）**——小时), 29 微米(**c（c）**——电子).

图4
注入（红色荧光）PKH26的共放大⁺具有选择性（绿色荧光）血小板标志物CD41的血小板(**c（c）**,d日,克)和CD61(电子,**（f）**,小时). 从野生型小鼠中分离血小板(**a、 c、e**)或转基因阿尔茨海默病小鼠(b条,d日,**（f）**——小时)用红色荧光染料PKH26标记，制备经心注入的器官型脑片，孵育2周，然后用血管标记物IV型胶原（Alexa-647，以黄色显示）或CD41/CD61（Alexa-488，以绿色显示）进行复染。作为阴性对照，一级抗体被省略(一,b条)绿色CD41/CD61染色无阳性，但红色荧光PKH26⁺血小板。注意，从转基因阿尔茨海默病小鼠中分离出的红血小板仅能穿透血管（如图（a）和（b）所示）。血小板标志物CD41和CD61与红色PKH26完全共定位⁺血小板，显示PKH26⁺血小板显示细胞内CD41和CD61免疫反应(克,小时). 比例尺输入克 = 5 微米(一——小时).

图5
经心输注红色PKH26血小板引起的血管损伤(一,d）从转基因阿尔茨海默病小鼠中分离得到。血管用IV型胶原染色（Alexa 647(b条)或凝集素-649(电子,小时). 图中给出了血管中穿透红色血小板的合并图片(**c（c）**,**（f）**). 抗鼠IgG染色（Alexa-488；克)显示船舶损坏。注意几个孔（中的箭头b条,电子,小时)在血管中，血小板穿透血管，表明血管受损。比例尺输入一 = 7 微米(一——我).

图6
血管中的基质金属蛋白酶（MMPs）。从野生型小鼠中分离血小板(一,**c（c）**,电子)或转基因阿尔茨海默病小鼠(b条,d日,**（f）**)用红色荧光染料PKH26标记，经心注入，制备器官型脑片，孵育2周，然后用凝集素649（以黄色显示）或MMP-2或MMP-9抗体（Alexa-488，以绿色显示）进行复染。作为阴性对照，一级抗体被省略(一,b条)无阳性绿色染色。注意，从转基因阿尔茨海默病小鼠中分离出的红血小板仅能穿透血管**（b）**,d日,**（f）**). 注意，MMP-2和MMP-9仅在血小板穿透血管时表达。比例尺输入(一) = 5 微米(一——**（f）**). 为了显示MMP-2和MMP-9的释放(**（f）**)或皮质血管(小时)从野生型或转基因小鼠中分离出来，孵育60 用ELISA法测定MMP-2和MMP-9的水平。数值为平均值 ± 扫描电镜（n = 10). 统计分析由学生进行T-Test（*p < 0.05). 注意血小板中MMP-2和MMP-9的释放显著增加(克)从转基因小鼠中分离，但不是从血管中分离(小时).

图7
血管中的β淀粉样蛋白、噻嗪红和间苯二酚染色。从野生型小鼠中分离血小板(一,**c（c）**)或转基因阿尔茨海默病小鼠(b条,d日,电子——n个)用红色荧光染料PKH26标记，经心注入，制备器官型脑片，孵育2周，然后用血管标记物凝集素649进行复染（以黄色显示）。免疫染色显示β-淀粉样免疫反应(**c（c）**,d日)或噻嗪红(电子——我)或Resorufin(j个——n个). 作为阴性对照，一级抗体被省略(一,b条)未显示阳性绿色染色，但仍显示红色荧光PKH26血小板。注意，从转基因阿尔茨海默病小鼠中分离出的红血小板仅能穿透血管(b条,d日,电子,j个). 注意β-淀粉样蛋白免疫反应、噻嗪红和Resorufin围绕血管，从转基因小鼠分离的血小板渗透(d日,电子,j个). 图**（f）**——克和k个——n）分别显示了图（e）和（j）中的单通道。比例尺输入一 = 5 微米(一——d日), 10 微米(电子,j个), 25 微米(**（f）**——我,k个——n个).

图8
穿透血管的血小板周围的炎症反应。从野生型小鼠中分离血小板(一,**c（c）**,电子,克)或转基因阿尔茨海默病小鼠(b条,d日,**（f）**,小时)用红色荧光染料PKH26标记，经心注入，制备器官型脑片，孵育2周，然后用凝集素649复染（以黄色显示）。小胶质细胞用Iba-1染色(一——**（f）**)或肿瘤坏死因子α(克,小时)，均配有Alexa-488（绿色）。注意，从转基因阿尔茨海默病小鼠中分离出的红血小板仅能穿透血管。注意血小板和小胶质细胞之间的距离显著（p < 0.05）血小板穿透血管时减少（41 ± 9 WT中的µm与19 ± 2 TG小鼠中的μm，n = 10, (电子,**（f）**). 比例尺输入一 = 15 微米(一,b条,电子,**（f）**)和5 微米(**c（c）**,d日)、和10 微米(克,小时).

图9
皮质血管中血小板穿透周围的细胞过程（示意图）。该图显示了穿透血管的血小板周围的假定过程（取自10张代表性共焦图像）。穿透性血小板在黄色血管中以红色显示，共同标记物以绿色显示。我们的数据显示（1）血小板标志物CD41和CD61与PKH26红血小板完全共定位(一,b条)，（2）基质金属蛋白酶-2和-9被激活并释放，可能在血管损伤中发挥作用(**c（c）**,d日)（3）血小板产生并释放β-淀粉样蛋白，这也被噻嗪红和Resorufin染色(电子——我)和（4）血小板渗透导致炎症过程，如小鼠IgG内流所示(**（f）**)、小胶质细胞活化和迁移(小时)肿瘤坏死因子α的表达增强(j个).

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