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.2019年1月：20:167-181。
doi:10.1016/j.redox.2018.10.003。 Epub 2018年10月9日。

单胺氧化酶-A通过Bcl-2磷酸化促进人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的保护性自噬

阿斯利汉·乌根-克鲁塞克 1, 西奥多西 2, 朱莉娅·菲茨杰拉德 三, 佛罗伦斯·伯特 4, 克里斯托夫·乌费尔 5, 大卫·J·布考克 6, 帕特里克·于威曼 7, 林恩·贝德福德 8, E埃伦·比列特 2
附属公司

单胺氧化酶-A通过Bcl-2磷酸化促进人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的保护性自噬

阿斯利汉·乌根-克鲁塞克等。 氧化还原生物. 2019年1月.

摘要

单胺氧化酶（MAOs）位于线粒体外膜上，是治疗神经系统疾病的药物靶点。MAO通过氧化脱氨作用控制大脑中的神经递质水平，并通过其催化副产物H促进活性氧（ROS）的生成2O（运行）2ROS水平升高可能调节线粒体功能，线粒体功能障碍与大量疾病有关。然而，在神经元模型中，MAO-A介导的ROS生成的下游效应之前尚未被研究。在这项研究中，使用MAO-A过度表达的神经母细胞瘤细胞，我们证明，较高水平的MAO-A蛋白/活性会导致基础ROS水平增加，同时伴随着蛋白质氧化的增加。MAO-A水平升高导致线粒体蛋白的赖氨酸-63连接泛素化增加，并通过Bcl-2磷酸化促进自噬。此外，MAO-A在线粒体外膜局部产生的ROS促进了dynamin-1样蛋白的磷酸化，导致线粒体断裂和清除，而不会完全丧失线粒体膜电位。细胞ATP水平在MAO-A过度表达后保持不变，复合物IV活性/蛋白质水平增加，揭示了MAO-A水平与线粒体功能之间的密切关系。最后，MAO-A水平增加的下游影响取决于胺底物的可用性，并且在存在外源底物的情况下，细胞活力显著降低。本研究首次表明，MAO-A生成的ROS参与质量控制信号传递，MAO-A蛋白水平的增加导致保护性细胞反应，以介导对受损大分子/细胞器的去除，但底物可用性可能最终决定细胞命运。后者在帕金森氏病等疾病中尤其重要，其中多巴胺前体被用于治疗疾病症状，并强调含有MAO-a的多巴胺能神经元的命运可能取决于MAO-a水平和儿茶酚胺底物的可用性。

关键词：自噬；单胺氧化酶；神经变性；活性氧物种。

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数字

fx1型
图形摘要
图1
图1
过表达MAO-A的SH-SY5Y克隆的特征（A） 通过qRT-PCR测定稳定SH-SY5Y细胞对照（Ctrl）和MAO-A过表达（MAO-A+）克隆中MAO-A mRNA的表达。（B） MAO催化活性在Ctrl和MAO-A+电池中通过辐射法测量，使用14C-酪氨酸作为底物，表示为14C/min/mg总蛋白± SEM.MAO-A活性在MAO-A+克隆中增加了2.5–5.1倍。（C） 对Ctrl和MAO-A+克隆中的MAO-A蛋白水平进行Western blot分析，确认MAO-A＋克隆中MAO-A蛋白质水平增加。在MAO-A+克隆中，MAO-A蛋白水平增加了3.8–4.4倍，每条通道下都显示了条带强度。Tubulin用于确认等负荷。（D） 使用免疫细胞化学方法在Ctrl（面板i）和MAO-A+细胞（面板ii）中显示MAO-A蛋白（绿色）的典型共焦图像。细胞核用碘化丙啶（红色）复染。显微照片代表> 6个独立实验。第三组显示MAO-A过度表达细胞的放大图。第四组显示通过MAO-A（绿色）和细胞色素c氧化酶（红色）的双重免疫荧光标记，MAO-A蛋白在MOA-A+细胞中的线粒体定位。面板显示×63放大倍数和缩放。（E） 对全细胞匀浆（T）、富含线粒体（M）和细胞溶质（C）组分中MAO-A+细胞中MAO-A蛋白的Western blot分析表明，MAO-A蛋白质继续定位于线粒体；线粒体外膜蛋白VDAC用于证明分馏效率，铜酞菁总蛋白染色显示蛋白质负载相等。误差条代表n的SEM = 三。
图2
图2
MAO-A过度表达导致基础活性氧（ROS）水平增加。（A）使用DCDHF荧光探针监测Ctrl（面板i）和MAO-A+（面板ii和iii）细胞活培养物中的ROS水平。细胞与100 37μM DCDHF 50°C min，然后去除染料并改变DCDHF荧光（激发502 nm/发射523 nm）立即使用徕卡CLSM倒置共焦激光扫描显微镜进行监测。为了抑制MAO-A活性，用1 µM氯霉素（MAO-A抑制剂）2 h（第三组）。显示了具有代表性的图像；在每个独立实验中，使用相同的激光功率、增益和物镜拍摄图像。（B）Het荧光测量2 实验期间，溶液中存在μM Het，但未使用预培养。使用配备20×萤石物镜的外荧光倒置显微镜进行测量。对Het的氧化进行监测，并比较对照组和MAO-A+细胞的氧化速率。（C）用Oxyblot蛋白氧化检测试剂盒和Western blotting分析观察Ctrl和MAO-A+细胞中氧化修饰蛋白的水平。羰基由2,4-二硝基苯肼（DNPH）衍生，然后由蛋白质的附加DNP部分的特异性抗体（随试剂盒提供）检测。MAO-A+细胞中检测到蛋白质羰基化增加（p = 0.0032). MAO-A+细胞提取物的缓冲区衍生化可作为阴性对照（-have）。（D）在H存在的情况下测量重组MAO-A和LDH的活性2O（运行）2将酶重新悬浮在分析缓冲液中，并与一定范围的H孵育2O（运行）2(0.1–10 mM）或37时在分析缓冲液中（作为对照） 30°C 活性测定前min。结果显示为未处理对照组的平均百分比± 三个独立实验的SEM（n = 3). 采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的多重比较试验来评估H2O（运行）2MAO-A和LDH酶活性。（E）以乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-7-氨基甲基香豆素（Ac-DEVD-AMC）为底物，通过caspase-3活性评估Ctrl和MAO-A+细胞的凋亡细胞死亡。在360度激发下读取荧光 nm和460时的发射 每5纳米 4分钟 37小时 摄氏度。对蛋白质含量的数据进行归一化，并表示为Δ荧光单位/min/µg蛋白质，其中n = 5（F）Ctrl和MAO-A+细胞中前胱天蛋白酶3和裂解胱天蛋白酶3蛋白水平的蛋白质印迹分析。条带强度被量化并归一化为总蛋白水平，并且显示为与Ctrl细胞相比的倍数变化。裂解半胱天冬酶3的双谱带总强度（在17/19检测到 kDa）。进行学生的T检验以比较半胱天冬酶3水平。Tubulin用于确认等负荷。误差条代表n的SEM = 3.*P（P）<0.05，**P<0.01.
图3
图3
MAO-A过表达通过Bcl-2磷酸化激活自噬。（A）在存在和不存在Bafilomycin A的情况下，Ctrl和MAO-A+细胞中的LC3B-I和LC3B-II蛋白水平1（巴西金融协会，100 nM）使用Western blotting监测治疗。方框（i）中显示了LC3B-II的长期暴露。使用Western blotting监测Ctrl和MAO-A+细胞中的基本P62蛋白水平（ii）。带强度被量化并归一化为总蛋白水平，显示为与Ctrl细胞相比的倍数变化（iii）。Tubulin用于确认等负荷。在Bafilomycin A作用下，MAO-A+细胞的LC3B-II显著增加1治疗（p = 0.002）和较低的基础p62水平（p = 0.01). 用p62抗体免疫沉淀Ctrl和MAO-A+细胞匀浆，然后用p62和LC3B抗体免疫印迹（iv）。每条车道下都显示了波段强度。MAO-A+细胞中用p62进行更多LC3B免疫沉淀（对照细胞中的LC3B/p62比率从0.5增加到MAO-A＋细胞中的0.7），表明p62-LC3B相互作用增加。（B）Ctrl和MAO-A+细胞中Beclin 1、磷酸化Bcl-2（p-Bcl-2）和Bcl-2水平的代表性免疫印迹和定量。Beclin 1带强度被量化并归一化为总蛋白水平，显示为与Ctrl细胞相比的倍数变化。在Ctrl和MAO-A+细胞中，磷酸化Bcl-2和Bcl-2带强度被量化并表示为p-Bcl-2/Bcl-2比率。GAPDH用于确认等负荷。误差条代表n的SEM = 3.学生的t吨-进行测试以比较Ctrl和MAO-A+*P（P）<0.05.
图4
图4
MAO-A过度表达导致K63泛素化增加。（A–D）来自Ctrl和MAO-A+细胞的总匀浆的K63多泛素（K63 polyUb）和聚泛素（polyUb-）蛋白质印迹以及线粒体和细胞溶质部分的K63 poly Ub-蛋白质印迹。使用K63链特异性多泛素抗体检测样品中蛋白质的K63泛素化。使用抗泛素抗体来检测所有的多泛素链。微管蛋白、MT-ND1和LDH用于分别确认总、线粒体和胞质组分的相等负载。（E）条带强度被量化并归一化为总蛋白水平，并且显示为与Ctrl细胞相比的倍数变化。MAO-A+细胞K63 polyUb显著升高（p = 0.037）在总匀浆和线粒体部分（p = 0.045). 学生的吨-进行测试以比较Ctrl和MAO-A+。误差条代表n的SEM = 3.*P（P）<0.05，**P<0.01.
图5
图5
MAO-A过度表达导致线粒体断裂。（A）线粒体网络图像通过线粒体红染色获得。使用A1R点扫描倒置共焦显微镜对活细胞成像。显示了具有代表性的图像。（B–D）对45–50个Ctrl和MAO-A+细胞进行成像，并使用惠更斯Essential软件算法测量每个细胞的长度、体积和物体数量。Mann-Whitney-Wilcoxon公司单位-进行测试以比较Ctrl和MAO-A+。MAO-A+细胞显著缩短线粒体长度（p = 0.008）和线粒体片段数量增加（p = 但MAO-A过表达对线粒体网络总长度没有影响（p = 0.214）和体积（p = 0.477）。误差条代表SEM.n = 6.*P（P）<0.05，**P<0.01.
图6
图6
MAO-A过度表达导致线粒体裂变蛋白增加。（A）Ctrl和MAO-A+细胞中磷酸化drp1（p-drp1）、drp1和opa1水平的代表性蛋白质印迹和定量。带强度被量化并归一化为总蛋白水平，显示为与Ctrl细胞相比的倍数变化。Tubulin用于确认等负荷。（B）Ctrl和MAO-A+细胞中的mtDNA拷贝数。使用基于探针的多重Taqman实时PCR分析进行分析。使用从每个细胞系的MTND1-B2M值获得的2-ΔCt方法计算MtDNA拷贝数。（C）使用JC-1染料评估线粒体膜电位。在490的激发/发射波长下测量荧光 纳米/520 nm和490 纳米/590 比较Ctrl和MAO-A+细胞中的红色/绿色荧光比率。线粒体膜干扰物CCCP（50 µM）用作阳性对照。误差条代表n的SEM = 3个独立实验。学生的t吨-进行测试以比较Ctrl和MAO-A+*P（P）<0.05.
图7
图7
MAO-A过度表达对线粒体电子传递链和ATP的影响。（A）在富含线粒体的Ctrl和MAO-A+细胞组分中评估复合物I–IV和柠檬酸合成酶活性。MAO-A+细胞具有明显更高的复合物IV活性（p = 0.004).（B）使用SWATH质谱分析检测线粒体呼吸链复合物IV亚单位的差异表达。检测到7个复合IV亚单位，其中6个复合IV子单位的MAO-a+细胞增加了1.43–2.58倍。（C）使用Western blotting监测Ctrl和MAO-A+细胞中的复合物I-V和柠檬酸合成酶（CS）蛋白水平。用抗体鸡尾酒对印迹进行检测，检测到复合物I（NDUFB8）、复合物II（SDHB）、复合物质III（UQCRC2）、复合液IV（细胞色素c氧化酶亚基II，MT-CO2）和复合物V（ATP5A）的亚基。用针对CI（MT-ND1）、CIV（细胞色素c氧化酶亚基I，MT-CO1）和柠檬酸合成酶（CS）的抗体对相同样本进行检测。带强度被量化。学生的t吨-进行测试以比较Ctrl和MAO-A。（D）使用基于发光的分析测定ATP水平。细胞培养1 DMEM中的h包含10 mM葡萄糖（Glu），10 mM葡萄糖加3 µg/ml寡霉素（oli）（糖酵解ATP生成），10 mM 2-脱氧葡萄糖（2-DG）加1 mM（或10 mM）丙酮酸（Pyr）（氧化ATP生成）或10 mM 2-DG加1 mM（或10 mM）丙酮酸加3 µg/ml寡霉素。学生的t吨-进行测试以比较Ctrl和MAO-A+。误差条表示n的SEM = 3个独立实验*P（P）<0.05，**P<0.01.
图8
图8
过量MAO底物可用性对细胞活力的影响。（A）100天后使用MTT还原分析量化细胞活力 微米-1 mM酪胺暴露48小时。结果表示为Ctrl和MAO-a+细胞未经处理的对照组的百分比，其中n = 6-8.为了抑制MAO活性，用氯霉素（1）处理细胞 µM），一种不可逆的MAO-A抑制剂，适用于30 添加酪胺前min。采用双向方差分析（ANOVA）和Bonferroni多重比较检验对多重比较进行统计显著性检验。通过比较每种浓度的细胞活力和未经处理的对照组来评估酪胺的作用（*P<0.05，**P<0.01，****页<0.0001). 为了评估MAO-A抑制剂的保护作用，将每种浓度的经氯霉素加酪胺处理的样品与仅经氯霉素处理的样品进行比较。除最高浓度（1 mM酪胺48 小时，••••第页<0.0001).（B）200个细胞后，Ctrl（面板i、ii、v和vi）和MAO-A+（面板iii、iv、vii和viii）细胞的代表性相控显微镜图像 48μM酪胺处理 h（面板v-viii）。添加氯霉素（+氯霉素，第二、四、六和八组）逆转了酪胺对MAO-A+细胞的有害影响（注意第八组与第七组相比显示的细胞形态）。
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