Nuclear PKM2 promotes the progression of oral squamous cell carcinoma by inducing EMT and post-translationally repressing TGIF2

doi:10.18632/oncotarget.25850

.2018年9月18日；9(73):33745-33761.

doi:10.18632/noctarget.25850。

核PKM2通过诱导EMT和翻译后抑制TGIF2促进口腔鳞癌的进展

田中富美^1 2, 吉本昭平¹, 冈村和彦¹, 伊克贝（Tetsuro Ikebe）², 水池桥本¹

附属公司

¹福冈牙科学院生物医学科学部形态生物学系病理科，日本福冈814-0193，Sawara-ku Tamura。
²福冈牙科学院口腔与医疗管理科口腔与颌面外科口腔外科，日本福冈县佐拉区田村814-0193。

PMID： 30333907
PMCID公司：项目经理6173467
内政部： 10.18632/目标25850

核PKM2通过诱导EMT和翻译后抑制TGIF2促进口腔鳞癌的进展

田中富美等。 Oncotarget公司. 2018.

.2018年9月18日；9(73):33745-33761.

doi:10.18632/noctarget.25850。

作者

田中富美^1 2, 吉本昭平¹, 冈村和彦¹, 伊克贝（Tetsuro Ikebe）², 水池桥本¹

附属公司

¹福冈牙科学院生物医学科学部形态生物学系病理科，日本福冈814-0193，Sawara-ku Tamura。
²福冈牙科学院口腔与医疗管理科口腔与颌面外科口腔外科，日本福冈县佐拉区田村814-0193。

PMID： 30333907
PMCID公司：项目经理6173467
内政部： 10.18632/目标25850

摘要

丙酮酸激酶M2（PKM2）是一种糖酵解酶，作为一种代谢功能发挥作用，导致能量产生，这是癌症进展的关键，称为Warburg效应。在这项研究中，我们显示PKM2作为一种非代谢功能发挥关键作用，通过诱导上皮-间充质转化（EMT）促进人类口腔鳞癌（OSCC）中的癌细胞进展，EMT对癌细胞侵袭潜能和转化后TGIF2降解至关重要。PKM2免疫反应在侵袭性癌细胞的细胞质中较强，在具有EMT特征的梭形癌细胞的细胞核中明显。TGIF2核免疫反应在增生异常的上皮细胞中可见，但在癌细胞中受到抑制。体外分析表明，当EMT被刺激时，PKM2的细胞质表达转移到人OSCC衍生的HSC-4和SAS细胞的细胞核中。此外，在EMT诱导的HSC-4和SAS细胞中TGIF2的核表达受到明显抑制。我们发现在EMT诱导的HSC-4和SAS细胞中，TGIF2蛋白和mRNA表达不匹配，并通过MG132蛋白酶体抑制测定发现TGIF2蛋白通过泛素-蛋白酶体系统被翻译后降解。最后，在PKM2敲除试验中发现PKM2促进HSC-4和SAS细胞的进展。因此，我们阐明了PKM2的一种新的非代谢功能机制，通过PKM2核转位、随后诱导EMT和翻译后泛素蛋白酶体系统抑制TGIF2表达来促进OSCC的进展。

关键词：EMT；PKM2；TGIF2；华伯格效应；口腔鳞状细胞癌。

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利益冲突声明

利益冲突作者声明他们没有相互竞争的利益。

数字

**图1。通过免疫组化分析比较口腔上皮异型增生（DP）和口腔鳞癌（SCC）各分化中PKM2和TGIF2的表达与临床病理指标**
**（A）**PKM2的表达在DP（a）、高分化SCC（W）（b）、中分化SCC。PKM2免疫反应在DP（a）中较弱，但在W中明显，尤其是在每个癌细胞巢（b）的外围，在侵袭性或低分化癌细胞（c，d）中较强。PKM2的核表达如（c）中的箭头和（d）中的插图所示。TGIF2的表达如DP（e）、W（f）、M（g）和MP&P（h）所示。TGIF2在DP（e）的基底细胞或副基底细胞的细胞核中表达明显，但在SCC（f-h）中表达受到抑制。比例尺：100μm。**（B）**PKM2 TS（a，c，d）或TGIF2 LI（b）与临床病理指标之间的关系分析。SCC中PKM2 TS显著高于DP，并随着SCC分化不良逐渐增加（a）。W和MP&P（A）之间存在显著差异。尽管DP和W（b）之间没有显著差异，但TGIF2 LI随着SCC分化不良而显著降低。PKM2 TS在Ly/v渗透（perm）（+）和LN转移（meta）（+）中分别显著高于Ly/v渗透（-）和LN meta（-）。（d） ●●●●。采用材料和方法中描述的方法进行统计分析。统计显著性设置为^*第页<0.05,^**第页<0.01和^***第页<0.001.

**图2。在EMT非刺激条件（EMT（-））和刺激条件（EMT（+））下HSC-4细胞中PKM2和TGIF2的表达**
**（A）**EMT（-）和EMT（+）中N-钙粘蛋白、E-钙粘素、波形蛋白、PKM2和TGIF2的蛋白质印迹。分子量用箭头表示。**（B）**对A.N-cadherin（A）和vimentin（c）中所示条带的密度分析结果显著上调，而E-cadherin在EMT（+）中显著下调。TGIF2显著下调（e），PKM2呈上升趋势，但EMT（+）无显著差异（d）。通过学生t检验评估的统计显著性表示为^*第页<0.05和^**第页<0.01.

**图3。EMT诱导改变PKM2的亚细胞定位和TGIF2的表达**
**（A）**E-钙粘蛋白（a，c:绿色）、波形蛋白（b，d:绿色）、PKM2（E，g:绿色）、TGIF2（f，h:绿色）和f-肌动蛋白（a-h:红色）在EMT（-）（上图；a，b，E，f）和EMT（+）（下图；c，d，g，h）的HSC-4细胞中的免疫荧光细胞化学染色。显示了核DAPI染色（蓝色）的合并图像。EMT（+）中E-cadherin（c）的减少和vimentin（d）表达的增加证实了EMT的诱导。在EMT（+）中，PKM2从细胞质（e）转移到细胞核（g），TGIF2核表达（h）显著降低。比例尺：20μm。**（B）**通过western blotting分析，PKM2在EMT（-）和（+）的HSC-4细胞质和核组分中的亚细胞表达。PKM2免疫印迹在EMT（+）中明显，但在HSC-4细胞核组分的EMT（-）中不明显。GAPDH：细胞质内标记物，组蛋白H3：核内标记物。分子量用箭头表示。

**图4。EMT（+）中HSC-4细胞PKM2的敲除导致TGIF2表达的挽救**
**（A）**用siScramble（siScrbl）（a，c，E，g）或siPKM2（b，d，F，h）转染EMT（-）（上部面板；a，b，E，F）或EMT（+）（下部面板；c，d，g，h）中HSC-4细胞的波形蛋白（绿色）和E-cadherin（红色）以及TGIF2（绿色）与F-actin（红色）的双重免疫荧光细胞化学染色。EMT（+）中的siPKM2明显抑制EMT诱导，这表现为siPKM2（d）对EMT（＋）中波形蛋白表达的抑制。用siScrbl（g）显著抑制EMT（+）中TGIF2核表达。令人惊讶的是，这种TGIF2核抑制在EMT（+）中被siPKM2（h）拯救。比例尺：20μm。**（B）**Western印迹分析支持在EMT（+）中通过敲低HSC-4细胞中的PKM2来拯救TGIF2抑制，如A所示。具有siScrbl的EMT（+）中的TGIF2带弱于具有siScrbl的EMT（-）中的TGIF2带，这支持在EMT诱导中TGIF2表达的损失。在带有siPKM2的EMT（-）和EMT（+）之间，TGIF2谱带的差异不明显。分子量用箭头表示。**（C）**用siScrbl或siPKM2转染EMT（-）或（+）中HSC-4细胞的TGIF2核表达分析。与使用siScrbl的EMT（-）相比，使用siScrbl的EMT（+）中的TGIF2-LI显著降低。然而，与使用siScrbl的EMT（+）相比，使用siPKM2的EMT中TGIF2 LI的减少受到抑制。**（D）**实时qPCR分析显示，在使用siScrbl或siPKM2（n=3）的EMT（-）和EMT（+）之间，HSC-4细胞中TGIF2 mRNA的表达在统计学上没有显著变化。这些结果揭示了EMT诱导的HSC-4细胞中TGIF2蛋白和mRNA表达之间的不匹配，并且TGIF2核蛋白的表达是通过EMT诱导HSC-4的PKM2敲低来维持的。学生的t检验用于统计评估。NS：统计分析无显著性。

**图5。蛋白酶体抑制剂MG132对EMT（+）HSC-4细胞TGIF2表达的影响分析**
**（A）**显示了每种培养条件下HSC-4细胞TGIF2（绿色）和F-actin（红色）的免疫荧光细胞化学染色。TGIF2在MG132未治疗（MG132（-））（a）和治疗（MG133（+））（b）条件下的EMT（-）细胞核中主要表达于HSC-4细胞。EMT（+）和MG132（-）（c）中HSC-4细胞的核TGIF2表达受到明显抑制。然而，通过EMT（+）中MG132的处理，TGIF2的抑制在HSC-4细胞中被挽救，免疫反应主要见于细胞质，部分见于细胞核（d）。比例尺：20μm。**（B）**通过TGIF2 LI分析比较EMT（-）和（+）加或不加MG132的TGI2核表达。EMT（+）和MG132（-）或（+）的TGIF2 LI显著低于EMT（-）和MG1312（-）或者（+）。这些结果表明，无论MG132治疗如何，在EMT（+）中TGIF2核表达均受到抑制。**（C）**EMT（-）或（+）和MG132（-）或（+）（n=3）中HSC-4细胞中TGIF2的蛋白质印迹分析。EMT（+）MG132（-）中TGIF2的谱带弱于EMT（-）MG132（-）。然而，EMT（-）MG132（+）和EMT（+）MG132（+）之间的频带没有明显差异。这些结果表明，MG132抑制EMT（+）中TGIF2表达的抑制。分子量用箭头表示。

**图6。HSC-4细胞PKM2的功能分析**
**（A）**创伤愈合试验，评估HSC-4细胞在siScramble（siScrbl）或siPKM2转染细胞中迁移的能力。在每个EMT非刺激（EMT（-））（a）或刺激（EMT+）（b）状态的面板中显示受伤区域的闭合模式。上面板显示siScrbl转染细胞，下面板显示EMT（-）（a）或EMT（+）（b）中的siPKM2转染细胞。培养在开始后6小时（每个右栏）后停止，0小时（每个左栏）（a，b）。横线表示EMT（-）或EMT（+）（n=6）（c）中siScrbl（黑色横线）或siPKM2（灰色横线）转染细胞的损伤面积（CR）闭合率。**（B）**EMT（+）中HSC-4细胞的Transwell细胞迁移和侵袭分析。上面板显示siScrbl转染细胞，下面板显示siPKM2转染细胞（a）。条形图表示转染siScrbl（黑色条形图）或siPKM2（灰色条形图）的迁移或入侵细胞数量（b）（n=6）。统计显著性设置为^*第页<0.05和^**第页<0.01（A，B）。

**图7。解释PKM2和TGIF2调节作用的理论模型的示意图**
左侧是PKM2作为代谢功能的作用示意图。右侧是PKM2作为非代谢功能的作用示意图。TGIF2与细胞核中PKM2的二聚体结合，并通过泛素-蛋白酶体系统被蛋白酶体活性降解。这有助于并促进组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）向*CDH1型*（E-cadherin）启动子序列，随后去乙酰化组蛋白H3并抑制*CDH1型*转录。因此，PKM2的非代谢功能诱导EMT并促进癌细胞侵袭。

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