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.2018年12月10日；93（1）：e01285-18。
doi:10.1128/JVI.01285-18。 2019年1月1日印刷。

人MxB抑制丙型肝炎病毒复制

董荣毅 # 1, 倪安 # 1, 刘振龙 # 2, 冯文旭 三, 卡维塔·拉尼加 2, 李全杰 1, 芮周 1, 王静（音译） 1, 张永信 1, 周金铭 1, 张磊良 三, 静安 4, 秦成峰 5, 郭飞 三, 李晓宇 1, 陈亮 6, 山岑 7
附属公司

人MxB抑制丙型肝炎病毒复制

董荣毅等。 J维罗尔. .

摘要

I型干扰素（IFN）通过诱导抗病毒蛋白的表达来抑制病毒。据报道，干扰素诱导的黏液病毒抗性B（MxB）蛋白可抑制有限数量的病毒，包括HIV-1和疱疹病毒，但其抗病毒覆盖率有待进一步探索。在这里，我们发现MxB干扰丙型肝炎病毒（HCV）的RNA复制，并以亲环蛋白a（CypA）依赖性的方式显著抑制病毒复制。我们的数据进一步表明，MxB与HCV蛋白NS5A相互作用，从而削弱NS5A与CypA的相互作用以及NS5A定位到内质网，这两个事件对HCV RNA复制至关重要。有趣的是，我们发现MxB显著抑制黄病毒科这表明病毒对CypA的依赖性和病毒对MxB抑制的敏感性之间存在潜在联系。总的来说，这些数据已确定MxB是IFN介导的HCV感染抑制背后的关键因素，并且它们表明其他CypA依赖性病毒也可能受到MxB限制。重要性病毒黄病毒科家庭在世界各地造成重大疾病和死亡，从而对人类健康构成巨大威胁。这里我们证明了IFN-诱导的MxB限制了黄病毒科包括丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒和登革热病毒。这一发现不仅表明MxB在抗击这些主要致病性人类病毒方面具有积极作用，而且还显著扩大了MxB的抗病毒谱。我们的研究进一步加强了病毒对CypA的依赖性和对MxB限制的敏感性之间的联系，也表明MxB可能采用一种共同的机制来抑制不同的病毒。阐明MxB的抗病毒功能可以加深我们对干扰素介导的宿主抗病毒防御的理解，并可能为开发新型抗病毒治疗药物开辟新的途径。

关键词：CypA；黄蜂科；MxB；NS5A；丙型肝炎病毒。

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数字

图1
图1
MxB抑制HCV感染。（A） 使用Jc1 HCVcc感染Huh7.5.1细胞，这些细胞用多西环素（Dox）处理以表达MxB。在72 hpi时通过蛋白质印迹测定MxB蛋白和HCV核心蛋白的水平。使用NIH ImageJ软件定量核心和肌动蛋白的带密度。（B） 用qRT-PCR定量感染细胞中HCV RNA的水平。还测定了GAPDH mRNA水平，并将数据用作内部对照，以使病毒RNA水平正常化。（C）HCV感染是通过测定上清液中的Gluc活性来确定的。（D） HCV核心蛋白（绿色）和MxB（红色）的免疫荧光染色。DAPI染色（蓝色）显示细胞核。（E） 使用Image-Pro Plus 7.0C软件为随机选择的细胞（>30）测定了面板D中HCV核心蛋白（绿色）和MxB（红色）的Colocalization系数（Pearson和Manders系数值）。数据代表至少三个独立实验，数值表示为平均值±SD。对于面板A至C，数据归一化为控制组，控制值任意设置为1。
图2
图2
MxB在IFN介导的HCV感染抑制中起重要作用。（A） MxB在不同细胞系中的表达水平。用干扰素-α-2b（500 IU/ml）处理HEK293T、Huh7和Huh7.5.1细胞48 h.通过Western blotting测定MxB和SamHD1的水平。使用（B和D）Jc1 HCVcc感染转染靶向MxB或控制干扰siRNA（siNT）的Huh7细胞，然后用50 IU/ml IFN-α-2b（B）或1000 IU/ml干扰素-α-2b（D）。通过Western blotting测定MxB水平。通过在72 hpi时测量Gluc活性来评估HCV感染。（C） 用IFN-α-2b（0、50和500 IU/ml）处理Huh7细胞48 h.通过qRT-PCR定量MxB、MxA、Viperin和ISG56的mRNA拷贝。（E） 用靶向MxB的siRNA或对照干扰siRNA（siNT）转染Huh7细胞，并用50 IU/ml IFN-α-2b处理48小时 h、 通过qRT-PCR检测MxB、MxA、Viperin和ISG56的mRNA水平。（F） 用表达MxB-Flag的质粒转染Huh7细胞48 h、 qRT-PCR检测MxB、MxA、Viperin和ISG56的mRNA水平。数据代表至少三个独立实验，数值表示为平均值±SD。对于面板B和D到F，数据归一化为控制组，控制值任意设置为1。
图3
图3
MxB的NLS是其抗HCV活性所必需的。（A） 野生型（WT）和突变MxB蛋白的示意图。每个结构域的位置由氨基酸数表示。（B） 通过将表达Flag标记野生型和突变MxB的质粒转染Huh7.5.1细胞，然后感染Jc1 HCVcc，检测MxB突变体的抗HCV活性。数据代表至少三个独立实验，数值表示为平均值±SD。数据归一化为对照组，控制值任意设置为1。
图4
图4
MxB抑制HCV的RNA复制。（A） Huh7.5.1细胞要么用IFN-α-2b（0、50或500 IU/ml）处理，要么用MxB-Flag DNA转染（0、500或1000 ng）用于48 h、 和MxB水平通过Western blotting测定，并使用Li-Cor Odyssey系统定量。（B） 将表达MxB-Flag的质粒或空载体DNA（EV）作为对照转染Huh7.5.1细胞，然后感染JFH1 HCVcc（MOI = 0.5). 通过Western blotting测定MxB和HCV核心水平。（C） 用qRT-PCR定量感染细胞中HCV RNA的水平。以GAPDH mRNA水平作为内部对照，使病毒RNA水平正常化。（D）通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定上清液中HCV核心水平来测定HCV的产生。（E） 通过感染Huh7.5.1细胞，然后在72 hpi条件下对新感染细胞中的病毒RNA进行qRT-PCR定量，测定上清液中感染子代病毒的水平。（F） MxB对HCV与靶细胞结合的影响。Huh7.5.1细胞与JFH1 HCVcc（MOI）孵育 = 0.5）在4°C下持续1 h。使用抗CD81抗体来防止HCV与其受体CD81结合。通过qRT-PCR测定病毒基因组RNA的数量来量化细胞表面附着的HCV颗粒。（G） MxB对HCV进入的影响。将Huh7.5.1细胞与JFH1 HCVcc孵育后，通过qRT-PCR测定病毒基因组RNA水平来量化进入Huh7.5-1细胞的HCV。在HCV感染前24小时，用干扰素-α-2b作为细胞的对照治疗。（H） 携带JFH1衍生亚基因复制子的Huh7细胞转染MxB-Flag质粒DNA，然后进行Western blotting检测MxB和HCV NS3的水平。（一） 用qRT-PCR检测HCV RNA水平。（J） MxB对HCV RNA翻译的影响。Huh7.5.1细胞与MxB-Flag质粒DNA共同转染在体外-合成的JFH1 mRNA或JFH1（GND）mRNA。通过蛋白质印迹测定MxB和HCV核心蛋白的水平。数据代表至少三个独立实验，数值表示为平均值±SD。对于面板B到J，数据归一化为控制组，控制值任意设置为1。
图5
图5
MxB对HCV的抑制依赖于CypA。（A） CypA敲除对Huh7.5.1细胞中HCV MxB抑制的影响。用shRNA敲除Huh7.5.1细胞中的内源性CypA，然后用MxB-Flag质粒DNA转染并用Jc1 HCVcc感染72 h。用Western blotting测定MxB和CypA的水平。通过测定Gluc活性来确定HCV复制水平。（B） 环孢素（CsA）和索夫韦（SOF）对MxB抑制HCV感染的作用。将MxB-Flag DNA瞬时转染Huh7.5.1细胞，然后在CsA或SOF存在下感染Jc1 HCVcc。Western blotting检测MxB的表达。通过检测Gluc活性监测HCV感染。（C） CsA对JFH1突变体DEYN感染的影响。将Hh7.5.1细胞以0.5的MOI感染JFH1或DEYN突变株，然后以指示浓度用CsA处理72小时。通过病毒基因组RNA的定量测定HCV复制。通过对感染细胞中病毒RNA的qRT-PCR定量测定HCV复制水平。数据代表至少三个独立实验，数值表示为平均值±SD。对于所有面板，数据归一化为控制组，控制值任意设置为1或100%。
图6
图6
MxB干扰CypA与HCV蛋白NS5A的相互作用。（A） MxB及其突变体对NS5A与CypA相互作用的影响。MxB-Myc、NS5A-Flag和CypA-HA共表达。利用抗HA抗体进行免疫沉淀，以降低CypA-HA。通过Western blotting（IB）测定共沉淀NS5A-Flag的水平。（B） 使用NIH ImageJ软件测定A组蛋白质印迹中的蛋白质带强度。数据归一化为控制组，控制值任意设置为1。（C） MxB破坏了NS5A和CypA的Colocalization。Huh7.5.1细胞与NS5A-Flag、CypA-HA和MxB-Myc或其突变体共同转染。细胞被固定并用抗Flag（红色）、抗HA（绿色）和抗Myc（蓝色）抗体染色。显示了具有代表性的图像。棒材，5 微米。（D） 对随机选择的细胞进行CypA（绿色）和NS5A（红色）的染色性评估(n个 > 30）使用Image-Pro Plus 7.0C软件。数据代表至少三个独立实验，数值表示为平均值±SD。
图7
图7
MxB和NS5A交互需要NS5A的域I。（A） MxB与NS5A蛋白相互作用。MxB-Myc与标记的NS3、NS4A或NS5A共表达。使用抗Flag抗体进行免疫沉淀以去除Flag标记蛋白。通过Western blotting测定共沉淀MxB-Myc的水平。（B） MxB Myc与NS5A Flag相互作用。用NS5A-Flag和MxB-Myc野生型或突变DNA转染HEK293T细胞。48小时后，用抗Myc抗体进行免疫沉淀以降低MxB。通过使用免疫印迹的抗标记抗体检测沉淀材料中是否存在NS5A-Flag。（C） NS5A关键领域的示意图。每个结构域的位置由氨基酸数表示。（D） 删除NS5A中的域I可消除其与MxB的交互作用。NS5A-Flag及其缺失突变体与MxB-Myc在HEK293T细胞中共表达。用抗标记抗体沉淀NS5A-Flag及其突变蛋白，并用抗Myc抗体进行Western blotting检测沉淀材料中是否存在MxB-Myc。（E和F）MxB破坏CypA与NS5A（DI）（E）或NS5A的相互作用（DEYN）（F）。用抗HA抗体进行免疫沉淀，以降低CypA-HA。通过使用抗标记抗体的Western blotting测定共沉淀NS5A-Flag及其突变体的水平。数据代表至少三个独立实验。
图8
图8
MxB干扰NS5A对ER的定位。（A）MxB与ER标记PDI的最小共定位。将MxB-Flag质粒DNA转染Huh7.5.1细胞48 h，并用抗Flag（红色）和抗PDI（绿色）抗体对MxB-Flag和PDI进行染色。DAPI染色显示细胞核。最后一个面板是所选区域的放大图像。（B） PDI和NS5A的Colocalization被MxB破坏。NS5A-Flag、MxB-Myc和MxB-Myc突变体在Huh7.5.1细胞中瞬时表达，并用抗标记（红色）和抗Myc（蓝色）抗体染色检测。ER标记PDI为绿色。显示了具有代表性的图像。棒材，5 微米。（C） 对于随机选择的细胞（>30），确定NS5A（红色）和PDI（绿色）之间的共定位比率，并绘制成直方图。数据代表至少三个独立实验，数值表示为平均值±SD。
图9
图9
MxB抑制登革热病毒和日本脑炎病毒。（A） 将MxB-Flag DNA瞬时转染Vero细胞，然后以0.01的MOI感染JEV（SA14-14-2）。48小时后，用qRT-PCR测定感染细胞中JEV RNA的水平。通过蛋白质印迹检测MxB-Flag的表达。（B） 寨卡病毒（PLCal_ZV）（MOI = 0.5）用于感染瞬时表达MxB-Flag的Vero细胞。在48 hpi时，通过qRT-PCR测定感染细胞中寨卡病毒RNA的水平。（C） Vero细胞瞬时转染MxB-Flag DNA，然后感染DENV2（Tr1751）（MOI = 0.5). 48小时后，收集上清液进行菌斑试验，以测量DENV2的滴度。（D） CsA对HCV、JEV和ZIKV复制的影响。HCV（卫生部） = 0.5），JEV（MOI） = 0.01）和ZIKV（MOI = 0.5）在不同剂量的CsA（0.25μM，0.5μM，1）存在下感染Huh7.5.1细胞 μM和2 μM）。48小时后，通过qRT-PCR测定病毒RNA水平。（E和F）MxB对NS5表达的影响。JEV NS5-Flag（E）或DENV NS5-Flang（F）与不同剂量的MxB-Myc共表达24小时，然后用MG132治疗。通过Western blotting检测NS5和MxB的表达。二甲基亚砜。（G） MxB与NS5A（DEYN）、JEV NS5和DENV NS5相互作用。用抗Flag抗体进行免疫沉淀，以拉下标记有Flag的NS5A（DEYN）、JEV NS5和DENV NS5。通过Western blotting测定共沉淀MxB-Myc的水平。
图10
图10
MxB通过阻断NS5A和CypA的相互作用抑制HCV复制的示意图。在没有干扰素的情况下，不表示MxB。CypA与NS5A结合并促进HCV在内质网的复制。当MxB在IFN刺激下表达时，CypA和NS5A的相互作用被MxB与NS5A的结合所中断。因此，NS5A不能定位于ER，HCV感染受到限制。
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